탁도 측정 Limulus Amoebocyte 용해물 분석: 나노 제형 약물에서 내독소 오염을 검출하고 정량화하는 기술

초록

출처: Neun, B. W. et al., Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assay를 사용한 나노 제형에서 내독소 검출. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오는 PEGylated 리포솜 독소루비신 나노 제형에서 내독소 오염을 추정하기 위한 Limulus amoebocyte lysate(LAL) 분석의 탁도 측정 형식을 설명합니다. 내독소와 LAL 시약의 반응에 따른 용액의 탁도는 샘플의 내독소를 추정하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 나노 입자 샘플의 준비

1. LAL 등급의 물에서 연구 샘플을 준비합니다.
2. 만약 sample pH가 6-8 범위를 벗어나면 발열원이 없는 수산화나트륨 또는 염산을 사용하여 pH를 조정합니다.
3. LAL 등급의 물을 사용하여 연구 샘플의 여러 희석을 준비합니다. 최대 희석량이 최대 유효 희석(MVD)을 초과하지 않는지 확인합니다.

2. LAL 형식 간에 공통적인 시약 준비

1. 발열원이 없는 LAL 시약수를 사용하여 농축된 수산화나트륨 스톡을 희석하여 0.1N 농도의 작업 용액을 준비합니다.
2. 발열원이 없는 LAL 시약수를 사용하여 농축 염산 스톡을 희석하고 0.1N의 최종 농도에서 작동 용액을 준비합니다.
3. 대조 표준 내독소(CSE)의 준비
   1. 제조업체에서 제공한 분석 인증서에 따라 CSE를 재구성합니다.
      메모: 카탈로그 번호 및 다양한 LAL 형식에서 주어진 CSE 제형의 적용에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
4. LAL 시약의 준비
   1. 제조업체에서 제공한 분석 인증서에 따라 LAL 시약을 재구성합니다.
      메모: 카탈로그 번호 및 다른 LAL 형식의 주어진 LAL 시약 제형의 적용에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

3. 탁도 LAL 분석

1. 교정 표준물질의 준비
   1. 900 μL의 LAL 등급 물과 100 μL의 CSE를 사용하여 0.001 - 1 EU/mL의 농도 범위에서 보정 표준물질을 준비할 수 있도록 필요한 만큼 중간 희석액을 준비합니다.
   2. 먼저 튜브에 라벨을 붙이고 각 튜브에 900μL의 LAL 등급 물을 추가합니다. 그런 다음 100μL의 10EU/mL 용액을 추가하여 1EU/mL 농도의 보정 표준물질을 준비합니다.
   3. 위에서 설명한 대로 직렬 10배 희석을 반복하여 세 가지 더 낮은 보정 표준물질을 준비합니다. 0.001 - 1 EU/mL 범위의 4가지 보정 표준이 준비되었는지 확인합니다.
2. 품질 관리의 준비
   1. 50 μL의 1 EU/mL CSE 용액을 950 μL의 LAL 등급 물과 결합하여 0.05 EU/mL 품질 관리를 준비합니다.
3. IEC(Inhibition/Enhancement) 제어 준비
   1. 주어진 희석액에서 25 μL의 1 EU/mL CSE 용액과 475 μL의 테스트 나노 물질을 결합하여 0.05 EU/mL 농도의 IEC를 준비합니다.
4. 실험 절차
   1. 약 30분 전에 기기를 켜서 기기를 예열하십시오. 탁도 LAL에 적합하므로 검출 파장을 660nm로 설정합니다.
   2. 사용자 이름과 비밀번호를 입력하여 로그인합니다.
   3. 컴퓨터 화면에서 해당 아이콘을 클릭하여 소프트웨어(Table of Materials)를 엽니다.
   4. 소프트웨어 홈 화면에서 데이터 수집을 선택합니다. 테스트 ID 및 데이터 그룹 정보를 홈 화면의 일반 탭에 있는 해당 공간에 입력합니다.
   5. 하드웨어 탭을 클릭합니다. 드롭다운 메뉴에서 기기 유형을 선택합니다.
   6. LAL 탁도 방법을 선택하여 탁도 LAL에 적합한 검출 파장을 660nm로 설정합니다.
   7. 일련 번호, 시스템 ID 및 직렬 포트 정보가 화면에 나타나는지 확인합니다. 확인을 클릭합니다. 확인을 한 번 더 클릭하여 확인합니다.
   8. 샘플을 테스트한 순서와 동일한 순서로 샘플 ID를 입력합니다. 기본 버튼을 사용하여 negative control, standard curve 및 test s를 입력합니다.amples.
   9. 각 샘플에 대해 중복 튜브를 준비하고 200μL(테스트 비율 4:1) 또는 100μL(테스트 비율 1:1)의 음성 대조군(물), 보정 표준, 품질 관리, IEC 및 테스트 나노 입자를 사전 라벨링된 유리관에 추가합니다.
   10. 50μL(테스트 비율 4:1) 또는 100μL(테스트 비율 1:1)의 LAL 시약을 첫 번째 테스트 바이알에 추가하고 잠시 볼텍스한 다음 기기 캐러셀의 테스트 슬롯에 삽입합니다. 1:1 비율을 사용하는 경우 LAL 시약의 부피는 100μL입니다.
   11. 다른 샘플에 대해 위에서 설명한 절차를 반복합니다. 샘플을 한 번에 하나씩 처리합니다.
        

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
수산화나트륨	시그마	S2770	필요한 경우 샘플 pH를 6-8 사이로 조정하는 데 사용됩니다
염산	시그마	H9892	필요한 경우 샘플 pH를 6-8 사이로 조정하는 데 사용됩니다
LAL 시약	케이프 코드의 어소시에이츠	T0051	이 시약은 탁도 분석에만 사용할 수 있습니다
내독소 표준물질 제어	케이프 코드의 어소시에이츠	E0005	이 시약은 탁도 및 겔 응고 분석과 함께 사용할 수 있습니다
LAL 등급 물	케이프 코드의 어소시에이츠	WP0501	이 시약은 모든 LAL 형식과 함께 사용할 수 있습니다.
글루카쉴드 완충액	케이프 코드의 어소시에이츠	GB051-25	베타글루칸의 위양성 반응을 방지하는 데 사용됩니다.
일회용 내독소가 없는 유리 희석 튜브 12 x 75mm	케이프 코드의 어소시에이츠	TB240	이 튜브는 세 가지 분석 모두에 사용할 수 있습니다
일회용 내독소가 없는 유리 반응 튜브 8 x 75mm	케이프 코드의 어소시에이츠	TK100	이 튜브는 탁도 및 발색 분석과 함께 사용할 수 있습니다
발열원이 없는 0.25 및 1.0 mL 용량	라이닌	PPT25, PPT10	팁과 피펫은 내독소를 흡착하고 LAL 분석을 방해하는 침출물을 방출할 수 있습니다. 이러한 RAININ 팁이 사용되는 이유는 LAL 분석에서 최적의 성능이 검증 및 확인되었기 때문입니다
발열원이 없는 마이크로 원심분리기 튜브, 2.0 mL	에펜도르프	22600044	다른 동등한 소모품을 사용할 수 있습니다.
발열원 피 콤비팁, 5mL	에펜도르프	30089669	다른 동등한 소모품을 사용할 수 있습니다.
파이펫터 반복	에펜도르프	4982000020	다른 동등한 소모품을 사용할 수 있습니다.
마이크로세트리푸지	모든 브랜드		모든 브랜드에서 사용할 수 있습니다.
냉장고, 2-8C	모든 브랜드		모든 브랜드에서 사용할 수 있습니다.
소용돌이	모든 브랜드		모든 브랜드에서 사용할 수 있습니다.
냉동고, -20C	모든 브랜드		모든 브랜드에서 사용할 수 있습니다.
Pyros Kinetix 또는 Pyros Kinetix Flex 리더	케이프 코드의 어소시에이츠	PKF96	다른 악기를 사용할 수 있습니다. 그러나 이 분석에 사용된 LAL 시약 및 내독소 표준물질은 최적화가 필요할 수 있습니다. 다른 기기를 사용하는 경우 기기 및 LAL 키트 제조업체에 지침을 문의하십시오.

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