Gel-Clot Limulus Amoebocyte Lysate Assay: 나노 입자 제형에서 박테리아 내독소 검출 방법

초록

출처: Neun, B. W. et al., Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assay를 사용한 나노 제형에서 내독소 검출. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 투구게의 혈액 세포에서 유래한 Limulus Amoebocyte Lysate를 사용하여 나노 제형에서 박테리아 내독소의 존재를 결정하기 위한 겔 응고 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 나노 기반 제형을 포함한 의약품의 내독소 오염을 테스트하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 나노 입자 샘플의 준비

1. 연구용 샘플을 LAL 등급의 물에서 준비합니다.
2. 만약 sample pH가 6-8 범위를 벗어나면 발열원이 없는 수산화나트륨 또는 염산을 사용하여 pH를 조정합니다.
3. LAL 등급의 물을 사용하여 연구 샘플의 여러 희석액을 준비합니다. 최대 희석량이 최대 유효 희석(MVD)을 초과하지 않는지 확인합니다.

2. LAL 형식 간에 공통적인 시약 준비

1. 발열원이 없는 LAL 시약수를 사용하여 농축된 수산화나트륨 스톡을 희석하여 0.1N 농도의 작업 용액을 준비합니다.
2. 발열원이 없는 LAL 시약수를 사용하여 농축 염산 스톡을 희석하고 0.1N의 최종 농도에서 작동 용액을 준비합니다.
3. 대조 표준 내독소(CSE)의 준비
   1. 제조업체에서 제공한 분석 인증서에 따라 CSE를 재구성합니다.
      메모: 카탈로그 번호 및 다양한 LAL 형식에서 주어진 CSE 제형의 적용에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
4. LAL 시약의 준비
   1. 제조업체에서 제공한 분석 인증서에 따라 LAL 시약을 재구성합니다.
      메모: 카탈로그 번호 및 다양한 LAL 형식의 LAL 시약 제형의 적용에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

3. 젤 응고 LAL

참고: 이 분석은 반응관에서 응고의 육안 관찰 및 검출을 기반으로 샘플에서 내독소의 존재를 식별합니다. 실험 단계는 아래에 설명되어 있습니다. 벤치 시트를 사용하여 결과를 기록합니다. 이 벤치 시트는 필수 사항이 아니며 분석 결과를 기록하는 다른 방법도 허용됩니다. 이러한 벤치 시트의 예는 독자의 편의를 위해 보충 자료에 제공됩니다. 람다(l)는 겔-응고 분석의 감도이며 0.03 EU/mL입니다.

1. 분석된 테스트 샘플의 수를 수용하기 위해 필요한 만큼 반응 튜브에 라벨을 붙입니다. 분석의 1단계, 2단계 및 3단계에서 사용된 반복 횟수에 대한 자세한 내용은 벤치 시트를 참조하십시오.
2. 튜브당 100μL의 물, 대조군 또는 테스트 샘플을 분취합니다.
3. 최종 농도가 4λ가 되도록 CSE를 준비합니다.
4. 위에서 언급한 표준물질 100μL를 물 또는 테스트 샘플 100μL와 결합하여 CSE의 최종 농도 2λ를 달성합니다. 세 번 더 반복하여 람다와 절반 람다와 1/4 람다를 얻습니다.
5. 수조의 온도가 37°C인지 확인하십시오.
6. 테스트 튜브당 100μL의 용해물을 추가하고 잠시 와류를 일으킨 다음 모든 튜브가 있는 랙을 수조에 1시간 동안 놓습니다.
7. 부드러운 동작으로 튜브를 뒤집습니다.
8. 벤치 시트에서 "+"(단단한 응고) 또는 "-"(응고 또는 느슨한 응고가 없음)를 사용하여 결과를 수동으로 기록합니다.
9. USP BET 85에 따라 분석을 진행하고 벤치 시트를 지지 재료로 사용합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
LAL 시약	케이프 코드의 어소시에이츠	G5003	이 시약은 겔 응고 분석에 특이적입니다
내독소 표준물질 제어	케이프 코드의 어소시에이츠	E0005	이 시약은 탁도 및 겔 응고 분석과 함께 사용할 수 있습니다.
수산화나트륨	시그마	S2770	필요한 경우 샘플 pH를 6-8 사이로 조정하는 데 사용됩니다
염산	시그마	H9892	필요한 경우 샘플 pH를 6-8 사이로 조정하는 데 사용됩니다
LAL 등급 물	케이프 코드의 어소시에이츠	WP0501	이 시약은 모든 LAL 형식과 함께 사용할 수 있습니다.
글루카쉴드 완충액	케이프 코드의 어소시에이츠	GB051-25	베타글루칸의 위양성 반응을 방지하는 데 사용됩니다.
일회용 내독소가 없는 유리 희석 튜브 12 x 75mm	케이프 코드의 어소시에이츠	TB240	이 튜브는 세 가지 분석 모두에 사용할 수 있습니다
일회용 내독소가 없는 유리 반응 튜브 10 x 75mm	케이프 코드의 어소시에이츠	TS050	이 튜브는 겔-응고 분석과 함께 사용하기 위한 것입니다.
발열원이 없는 0.25 및 1mL 용량	라이닌	PPT25, PPT10	팁과 피펫은 내독소를 흡착하고 LAL 분석을 방해하는 침출물을 방출할 수 있습니다. 이러한 RAININ 팁이 사용되는 이유는 LAL 분석에서 최적의 성능이 검증 및 확인되었기 때문입니다
발열원이 없는 마이크로 원심분리기 튜브, 2.0 mL	에펜도르프	22600044	다른 동등한 소모품을 사용할 수 있습니다.
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냉장고, 2-8°C	모든 브랜드		모든 브랜드에서 사용할 수 있습니다.
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냉동고, -20C	모든 브랜드		모든 브랜드에서 사용할 수 있습니다.
수조, 37°C	모든 브랜드		모든 브랜드를 사용할 수 있지만 물의 흐름이 응고 형성에 영향을 미치고 위음성 결과를 초래할 수 있으므로 물 순환을 끄거나 비순환 수조를 사용하는 것이 중요합니다

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