발색 고분자 하이드로겔 기반 효소 스크리닝 분석: 합성 기질을 사용하여 탄수화물 활성 효소를 스크리닝하는 고처리량 방법

초록

출처: Schückel, J., et al. 새로운 불용성 발색 기질 분석 키트를 사용한 탄수화물 분해 효소의 고처리량 스크리닝. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오에서는 불용성 발색 폴리머 하이드로겔 기질을 사용하여 탄수화물 활성 효소 스크리닝을 위한 고처리량 분석을 시연합니다. 효소는 이러한 기질을 용해성 착색 산물로 분해하며, 이는 산물의 색 강도를 측정하여 정량화할 수 있습니다.

프로토콜

1. 분석 키트 플레이트의 활성화

1. 각 웰에 200μl 활성화 용액(키트와 함께 얻음)을 추가하여 96웰 필터(파란색 CPH-xylan 포함) 분석 키트 플레이트(재료 목록)를 활성화한 다음 교반 없이 실온에서 10분 동안 배양합니다.
2. 진공 매니폴드(내부의 스페이서 블록과 수집 플레이트로 사용되는 표준 투명 96웰 플레이트가 있음)를 사용하여 진공을 적용하여 기존 활성화 용액을 제거합니다. 이 단계에서는 진공 매니폴드 대신 2,700 x g에서 10분 동안 원심분리기를 사용할 수도 있습니다.
3. 100μl의 멸균수를 첨가하여 CPH 기판을 세척하고 진공(또는 원심력)을 가하여 안정제를 제거합니다. 이 단계를 두 번 더 반복하면 이제 플레이트를 사용할 준비가 된 것입니다.

2. 효소 반응

참고: 항상 buffer만 negative control로 포함시키고, 가능하다면 이전에 특성화된 효소를 positive control로 포함시키십시오. 통계적으로 적절한 반복 횟수를 사용합니다. CPH 기질은 pH 3.0 - 10.0 사이에서 안정적이며 각 웰에서 완충 말단 효소 용액의 총 부피는 180μl를 초과해서는 안 됩니다. 정제된 효소 용액 대신 식물 추출물 또는 배양 육수를 사용할 수도 있습니다.

1. 150μl 100mM 아세트산나트륨 완충액, pH 4.5 및 5μl 엔도셀룰라아제 용액(최종 농도 1U/ml)을 분석 키트 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
2. 제품 플레이트(마이크로타이터 플레이트 리더와 호환되는 클리어웰 플레이트)를 분석 키트 플레이트 아래에 놓아 진탕 중 반응 플레이트에서 잠재적인 누출을 수집합니다.
3. 25°C의 수평 셰이커에서 150rpm으로 30분 동안 분석 키트 플레이트를 배양합니다
   참고: 배양 중 분석 키트 플레이트에서 반응을 혼합하는 것은 일관되고 재현성 있는 결과를 얻는 데 중요합니다. CPH 기판은 최대 90°C까지 안정적입니다. CPH 기질로 알려지지 않은 효소 농도를 포함하는 배양 배지를 테스트할 때 배양 시간을 최대 24시간까지 늘려야 합니다. 적절한 배양 시간은 효소의 활성에 따라 다르지만 일반적으로 24시간 이내에 검출 가능한 활성이 없으면 효소가 테스트된 기질을 분해하지 않을 가능성이 높습니다. 활성 효소는 CPH 기질의 불용성 발색 다당류를 유색 상층액으로 보이는 용해성 발색성 올리고당으로 분해합니다.
4. 깨끗한 제품 플레이트를 스페이서 블록이 내부에 있는 진공 매니폴드 내부에 놓습니다.
5. 분석 키트 플레이트를 위에 놓고 진공을 적용합니다(최대 음압 -60kPa). 2,700 x g에서 10분 동안 원심분리기를 사용할 수도 있습니다.
   참고: 착색된 올리고당을 반응 산물로 포함하는 여과액은 이제 추가 분석을 위해 제품 플레이트에 있습니다.

3. 검출 및 정량화

1. 제품 플레이트의 각 웰에 있는 액체의 부피가 육안 검사로 거의 같은지 확인하십시오.
2. 플레이트 리더를 사용하여 파란색 CPH-xylan에 대한 595nm에서 수집 플레이트의 흡광도를 읽습니다.
3. 데이터 분석을 수행할 때 효소가 추가된 웰의 값에서 완충액 전용 음성 대조군 값을 뺍니다. 복제 우물에서 평균값과 표준 평균 오차(SEM)를 계산합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
분석 키트 플레이트	배당점		맞춤형 분석 키트 플레이트
활성화 솔루션	배당점		CPH 기판 활성화용
350ml 리시버 플레이트 진공 매니폴드용 스페이서 블록	폴 코퍼레이션	5015	스페이서 블록
96웰 멀티스크린 HV 필터 플레이트, 0.45μm, 투명, 비멸균	밀리포어	MSHVN4510	분석 플레이트
96웰 마이크로플레이트, 폴리프로필렌	Greiner 바이오 원	651201	기판을 세척한 후 수집 플레이트
Nunc MicroWell 96웰 마이크로플레이트	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	269620	제품 플레이트
다이어프램 펌프 MZ 2 NT	바쿠브란트	732000	진공 매니폴드와 함께 사용되는 진공 펌프
인포즈 HT Ecotron	인포즈 HT	4950132 (Buch & Holm)	수평 셰이커
스펙트라맥스 M5	분자 장치	10067-750 (VWR)	96웰 플레이트 흡광도 리더
진공 매니폴드	폴 코퍼레이션	5017	진공 매니폴드
엔도셀룰라아제(EGII) (Trichoderma longibrachiatum)	메가자임	E-셀터	셀룰라아제 [CEL]
α-아밀라아제(Bacillus licheniformis)	메가자임	E-블람	아밀라아제 [에이미]