불용성 발색 바이오매스 기반 효소 스크리닝: 식물 바이오매스 분해 효소의 분해 활성을 평가하기 위한 분석

초록

출처: Schückel, J., et al. 새로운 불용성 발색 기질 분석 키트를 사용한 탄수화물 분해 효소의 고처리량 스크리닝. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 불용성 발색 바이오매스 또는 ICB를 사용하여 식물 바이오매스에서 복합 다당류를 분해하는 데 효과적인 효소를 스크리닝하는 분석을 보여줍니다. 효소는 ICB를 가수분해하여 용해성 염료 결합 올리고당을 방출하고 효소 활성은 반응 생성물의 비색 분석으로 평가됩니다.

프로토콜

1. 96웰 형식의 ICB 기질을 사용한 발색 분석

1. 효소 반응
   1. 150 μl 100 mM 아세트산 나트륨 완충액, pH 4.5 및 5 μl 31 U/ml 엔도-자일라나제 용액을 빨간색 ICB-밀 밀짚(웰의 최종 효소 농도: 1 U/ml)이 포함된 분석 키트 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
      메모: 분석 키트 플레이트(ICB 기질을 포함하는 96웰 필터 플레이트)는 문헌에 설명된 대로 제조됩니다(재료 목록 참조). ICB 기질은 pH 3.0 - 10.0 사이의 pH 범위를 가진 버퍼에서 안정적입니다. 항상 완충액만 음성 대조군으로, 상용 효소를 양성 대조군으로 포함하고, 통계적으로 적절한 수의 복제를 사용합니다.
      1. CPH 기판 플레이트와 같은 ICB 기판을 활성화하지 말고 100μl의 물로 3회 세척한 후 진공 여과 또는 원심분리를 수행하여 안정제를 제거합니다.
   2. 제품 플레이트를 기판 플레이트 아래에 놓아 쉐이킹 중에 기판 플레이트에서 잠재적인 누출을 수집합니다.
   3. 25°C에서 150rpm으로 2시간 동안 진탕하면서 반응을 배양합니다
      메모: 활성 효소는 ICB 기질의 불용성 발색 다당류를 유색 상층액으로 볼 수 있는 용해성 올리고당으로 분해합니다. ICB 기판은 최대 90°C까지 안정적입니다. 배양 배지와 같은 비정제 효소를 사용하는 경우 배양 시간을 최대 24시간까지 늘려야 합니다.
   4. 스페이서 블록이 내부에 있는 진공 매니폴드 내부에 제품 플레이트를 놓습니다.
   5. 분석 키트 플레이트를 위에 놓고 진공(최대 음압 -60kPa)을 적용하거나 원심 분리기를 사용하여 분석 키트 플레이트의 제품을 제품 플레이트의 웰로 여과합니다.
      메모: 착색된 올리고당을 반응 생성물로 포함하는 여과액은 이제 추가 분석을 위해 수집 플레이트에 있습니다.

2. 검출 및 정량화

1. 수집 플레이트의 각 웰에 있는 액체의 부피가 육안 검사로 거의 동일한지 확인하십시오.
2. 플레이트 리더를 사용하여 빨간색 ICB-밀짚에 대한 517nm에서 수집 플레이트의 흡광도를 읽습니다.
3. 데이터 분석을 수행할 때 — 완충액을 뺍니다 — 효소가 추가된 웰의 값에서 음의 대조 값만 빼십시오. 복제 웰에서 평균값과 표준 평균 오차(SEM)를 계산합니다.
   메모: 알려지지 않은 효소를 스크리닝하는 경우, 효소 활성의 동적 범위에 대한 보다 자세한 데이터를 얻기 위해 희석 시리즈를 만드는 것이 좋습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
분석 키트 플레이트	배당점		맞춤형 분석 키트 플레이트
350ml 리시버 플레이트 진공 매니폴드용 스페이서 블록	폴 코퍼레이션	5015	스페이서 블록
96웰 멀티스크린 HV 필터 플레이트, 0.45μm, 투명, 비멸균	밀리포어	MSHVN4510	분석 플레이트
96웰 마이크로플레이트, 폴리프로필렌	Greiner 바이오 원	651201	기판을 세척한 후 수집 플레이트
Nunc MicroWell 96웰 마이크로플레이트	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	269620	제품 플레이트
다이어프램 펌프 MZ 2 NT	바쿠브란트	732000	진공 매니폴드와 함께 사용되는 진공 펌프
인포즈 HT Ecotron	인포즈 HT	4950132 (Buch & Holm)	수평 셰이커
스펙트라맥스 M5	분자 장치	10067-750 (VWR)	96웰 플레이트 흡광도 리더
진공 매니폴드	폴 코퍼레이션	5017	진공 매니폴드
엔도-β-1,4-자일라나제 M4 (아스페르길루스 니제르)	메가자임	E-시안4	자일라나제 [xyl]

년 ) 년