Differential Nuclear Staining Assay: Propidium Iodide 및 Hoechst Double Staining에 의한 미토칸 세포 독성을 측정하기 위한 분석

초록

출처: Pei, J. et al., 미토칸 세포 독성의 정확한 측정을 위한 자동 차등 핵 염색 분석. J. Vis. 특급 (2020)

이 동영상은 약물에 민감한 암세포와 건강한 변이에 대한 미토칸의 세포독성 효과를 검출하는 핵 염색 방법을 보여줍니다. 프로피듐 요오드화물 및 Hoechst 염료와 같은 DNA 결합 염료를 사용한 이중 염색은 죽은 세포와 살아있는 세포를 명확하게 구분하여 약물의 세포 독성을 평가하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 세포 독성 분석 : 설정

1. 적절한 배지(무혈청 또는 1, 2.5 또는 5% FBS RPMI-1640)에서 원하는 농도의 관심 화합물 용액을 준비합니다.
   1. 단일 화합물의 세포 독성을 측정하려면(예: 효과적인 용량을 결정하기 위해) 최종 농도의 2배에서 화합물을 준비합니다.
   2. 화합물 조합의 세포 독성을 측정하려면 최종 농도의 4배에서 화합물을 준비합니다.
   3. 동일한 양의 용매를 적절한 매체와 혼합하여 용매 전용 대조군을 준비합니다. 예를 들어, DMSO와 메탄올에 용해된 화합물을 테스트하는 경우 각 용매에 대해 용매 전용 제어를 수행합니다.
2. 배양 접시 또는 플라스크에서 세포를 15mL 코니컬 튜브로 수집합니다.
3. 10μL의 세포 현탁액을 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 10μL 0.4% 트리판 블루로 염색합니다. 혈구계를 사용하여 각 세포 공급원에 대해 생존 가능한 세포와 생존 불가능한 세포를 계수합니다.
4. 펠렛 세포를 200g에서 5분 동안 흡입 또는 디캔트 상층액.
5. 세포 밀도 3*10⁵ cells.
   의 세포 밀도에서 분석에 적합한 배지(무혈청 또는 1, 2.5, 5% FBS RPMI-1640)에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 참고 1: 3*10⁵ cells/mL의 세포 밀도는 15,000 cells/well의 시딩 밀도를 제공합니다. 파종(seeding) 밀도는 중요한 파라미터이며 이상적으로는 실험 전에 미리 정의해야 합니다. 파종 밀도는 1) 세포 크기 – 일반적으로 더 큰 세포는 더 낮은 밀도로 파종됩니다. 2) 치료 기간 – 세포는 일반적으로 더 오래 지속되는 실험을 위해 더 낮은 밀도로 파종되며, 3) 세포 분열 속도 – 분열률이 높은 세포는 더 낮은 밀도에서 파종됩니다. 최적화된 시딩 밀도의 구체적인 예: K562 세포, 더 큰, 24시간 지속 시간 – 10,000 세포/웰; MOLM-13 세포, 중간 크기, 24 시간 치료 – 15,000 / 웰; MOLM-13 세포, 48 시간 치료 – 8,000 / 웰; 작고 건강한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 24시간 치료 – 50,000/well; 1차 AML 세포, 24시간 치료 – 15,000-20,000/well.
   참고 2: 배지에 FBS가 존재하면 화합물의 활성에 영향을 미칠 수 있습니다. FBS의 농도를 줄이면 분석 결과를 더 쉽게 해석할 수 있지만 생리학적 정확도도 떨어집니다.
6. 멀티채널 피펫을 사용하여 1.5단계의 세포 현탁액 50μL를 96웰 플레이트의 각 웰에 시딩합니다.
7. 다음과 같이 화합물을 추가합니다.
   1. 단일 화합물 분석의 경우 각 웰에 50μL의 2x 화합물 용액을 추가합니다. 용매 대조군 웰의 경우 2배 농도에서 용매가 포함된 50μL의 테스트 매체를 추가합니다.
   2. 조합 분석의 경우 각 웰에 각 화합물(4x 용액) 25μL를 추가합니다. 단일 화합물 대조군 웰의 경우 25μL의 4x 화합물 용액과 25μL의 테스트 매체를 추가합니다. 용매 대조군 웰의 경우 50μL의 테스트 매체 또는 용매가 포함된 테스트 매체를 추가합니다.
      참고 1: DMSO의 최종 농도는 0.5%.
      를 초과해서는 안 됩니다. 참고 2: 부피가 적기 때문에 피펫이 각 웰의 벽에 닿는 화합물이 포함된 매체를 추가하는 것이 좋습니다.
8. 우물의 내용물이 섞이도록 접시를 부드럽게 두드립니다.
9. 37°C의 가습된 5%_CO2 분위기에서 적절한 시간(예: 24시간) 동안 플레이트를 배양합니다.

2. 세포 독성 분석 : Hoechst 33342 및 Propidium Iodide로 염색

1. 10x 염색 용액을 준비합니다. 이 용액은 각 실험 전에 새로 준비해야 하며 보관할 수 없습니다. 최종 염료 농도는 실험 전에 결정해야 합니다.
   1. 백혈병 세포주 및 원발성 백혈병 세포의 경우, 1mL의 10x 염색 완충액에는 10μL의 20mM Hoechst 33342와 50μL의 1mg/mL 프로피듐 요오드화물이 멸균 PBS에 포함되어 있습니다(최종 농도: Hoechst 33342 20μM, PI 5μg/mL).
   2. 건강한 PBMC를 위해 1mL의 10x 염색 완충액에는 10μL의 20mM Hoechst 33342와 10μL의 1mg/mL 프로피듐 요오드화물이 멸균 PBS에 포함되어 있습니다(최종 농도: Hoechst 33342 20 μM, PI 1 μg/mL).
      메모: 프로피듐 요오드화물의 최종 농도는 실험 전에 결정해야 합니다. PI 농도 범위(1, 2.5, 5 μg/mL)를 사용하여 세포를 테스트한 다음 Hoechst/PI로 계산된 생존율을 trypan blue를 통해 측정한 생존율과 비교해야 합니다. 위에 나열된 PI 농도는 배지 제어 웰의 표적 세포 생존율(백혈병 세포주의 경우 ~90% 이상, 건강한 PBMC의 경우 ~70% 이상)을 기준으로 선택되었습니다.
      주의: Hoechst 33342 및 프로피듐 요오드화물은 잠재적인 발암 물질입니다. 취급 시 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
2. 배양 후 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에 10μL의 10x 염색 완충액을 추가합니다.
   메모: 교차 오염을 방지하려면 피펫 팁이 매체에 닿지 않도록 하십시오.
3. 접시를 부드럽게 두드려 거품을 섞고 제거합니다. 37°C에서 15분 동안 염색합니다.
4. 플레이트를 200g에서 4분 동안 원 심분리하여 모든 세포를 플레이트 바닥으로 가져옵니다. 광고로 플레이트 바닥을 조심스럽게 닦습니다.amp kimwipe를 사용하여 이미징을 방해하는 섬유 및/또는 파편을 제거합니다.
   참고 1: 플레이트의 원심분리는 모든 세포가 이미지에서 캡처될 수 있는 가장 높은 기회를 보장합니다. 종종 죽은 세포가 분리되어 떠다니며 잘못된 세포 독성 값을 제공합니다. 원심분리는 이 효과를 완화합니다.
   참고 2: 플레이트는 원심분리 후 가능한 한 빨리, 이상적으로는 15분 이내에 이미징해야 합니다. 원심분리는 PI 염색의 선택성을 감소시킬 수 있으며 세포가 프로피듐 요오드화물을 천천히 축적할 수 있도록 할 수 있습니다. 죽은 세포를 시각화하여 얻은 정확도의 향상은 PI 염색의 약간의 증가보다 큽
니다

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2-데옥시-D-글루코스/2-DG	켐-임펙스	50-519-067
3-브로모-피루브산	알파 에자르	1113-59-3
96웰 플레이트	Greiner 바이오 원	655090	검은색 또는 투명한 평평한 바닥의 96웰 플레이트
Countess II 자동 세포 계수기	써모 피셔
Cytation 5 Cell Imaging 다중 모드 리더	(주)바이오텍
회스트: 33342	써모 피셔	62249	20 mM 용액; 최종 농도 1:1,000
HyClone 소 태아 세럼	GE 헬스케어	#25-514
m-클로로페닐하이드라존/CCCP	시그마 알드리치	C2759
PBS 정제	써모 피셔	BP2944100	1정 + 멸균수 200mL = PBS 용액 1개
페니실린-스트렙토마이신-글루타민 (100X)	지브코	10378016
프로피듐 요오드화물	써모 피셔	50-596-072	건조 분말; PBS에 1 mg/mL 재고, 최종 농도 5 μg/mL (백혈병 세포), 1 μg/mL (일반 PBMC)
로테논	아크 팜	AK115691
RPMI-1640 배지, L-글루타민 및 중탄산나트륨, 액체, 멸균 여과, 세포 배양에 적합	시그마 알드리치	R8758-500ML
트리판 블루 스테인(0.4%)	지브코	제15250-061
세포주
K562	증권 시세	CCL-243	CML 세포주
몰름-13	증권 시세		AML 세포주
몰트-4	증권 시세	CRL-1582	ALL 세포주
OCI-AML2	증권 시세		AML 세포주

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