용혈 분석: 인간 적혈구에서 칼슘 이오노포어에 의한 용해를 측정하는 시험관 내 방법

초록

출처: Bigdelou, P. et al., 칼슘 이오노포어를 사용한 적혈구 내 홍반증 유도. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 인간 샘플에서 칼슘-이오노홀드 유도 용혈 또는 적혈구 용해를 결정하기 위한 체외 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 파열된 적혈구에서 방출된 헤모글로빈을 정량화하여 용혈의 비율을 측정합니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 전혈에서 적혈구 분리

1. 4°C에서 보관된 ACD(Acid Citrate dextrose)에 있는 전혈 500μL를 마이크로 원심분리기 튜브에 추가합니다.
   메모: 전혈은 ACD로 구입했습니다. 회사에 따르면 1.5mL의 ACD가 7mL의 전혈(총 8.5mL)에 추가됩니다.
2. 전혈을 700 x g으로 실온(RT)에서 5분간 원심분리한 후 피펫을 사용하여 투명한 혈장과 얇은 담황색 털을 제거하여 붉은 적혈구층을 남깁니다.
3. 125mM NaCl, 5mM KCl, 1mM MgSO₄, 32mM HEPES, 5mM 포도당 및 1mM CaCl₂를 포함하는 링거 용액 1L를 준비합니다. 1.0M NaOH 2μL 방울을 추가하여 pH를 7.4로 조정합니다. 포도당이 없는 Ringer 용액을 준비하려면 동일한 프로토콜을 따르되 용액에 포도당을 포함하지 마십시오.
4. 세포 펠릿을 1.5mL의 Ringer 용액에 현탁시키고 RT에서 5분 동안 700 x g에서 원심분리한 후 상층액을 제거하여 Ringer 용액에서 적혈구를 2x 세척합니다.
5. 9,960μL의 포도당이 없는 링거 용액에 40μL의 적혈구 펠릿을 재현탁하여 0.4% 헤마토크릿을 만들어 10mL의 최종 부피에 도달합니다.
   메모: 헤마토크릿(Hematocrit)은 현탁액에 있는 적혈구의 부피 분율을 나타내는 데 사용되는 용어입니다. 0.4% 헤마토크릿은 0.4% 적혈구를 함유하는 현탁액입니다.
6. 세포 현탁액을 37°C에서 7일 동안 배양합니다.

2. ionomycin을 이용한 적혈구 치료 및 용혈 측정

1. 1mg의 이오노마이신 칼슘 염을 630μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 최종 농도 2mM에 도달합니다. 부분 표본은 -20 °C에서 보관하십시오.
2. 1.5단계에서 0.4% 헤마토크릿 1mL를 취하고 2mM 이오노마이신 0.5μL를 첨가하여 최종 농도 1μM에 도달합니다.37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
   1. 이오노마이신 치료가 없는 헤마토크릿 1mL를 음성 대조군으로 사용하십시오.
3. 이오노마이신 처리 및 처리되지 않은 헤마토크릿을 700 x g에서 RT에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하여 세포 펠릿이 튜브 바닥에 남도록 합니다.
4. 세포 펠릿을 1.5mL의 Ringer 용액에 현탁시키고 실온에서 5분 동안 700 x g에서 원심분리한 다음 상등액을 버리고 Ringer 용액으로 세포를 3x 세척합니다.
5. 용혈을 측정하려면 1.5단계에서 처리되지 않은 0.4% 헤마토크릿 1mL를 마이크로 원심분리기 튜브에 첨가하고 용혈에 대한 음성 대조군(0%)으로 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
6. 1.5단계에서 처리되지 않은 0.4% 헤마토크릿 1mL를 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 RT에서 5분 동안 700 x g으로 원심분리합니다.상등액을 제거하고 증류수 1mL를 세포 펠릿에 첨가하고 용혈(100%)에 대한 양성 대조군으로 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
7. 2.2단계에서 ionomycin 처리된 0.4% 헤마토크릿 1mL를 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다.
8. 처리되지 않은 세포, 처리된 세포 및 증류수에 있는 세포를 실온에서 5분 동안 700 x g으로 원심분리합니다.
9. 상층액 200μL를 취하여 96웰 플레이트에 추가합니다.
10. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 541nm에서 흡광도를 측정합니다.
11. 방정식 1을 사용하여 용혈을 계산합니다.
    %용혈 = (A_T -_{A 0})/(A₁₀₀ - A₀)*100
    여기서 A₀은 Ringer 용액 내 적혈구의 흡광도, A₁₀₀은 물 내 적혈구의 흡광도, A_T는 이오노마이신에 의해 처리된 적혈구의 흡광도입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96웰 플레이트	피셔 사이언티픽	Tel.: 12-565-331
염화나트륨2	피셔 사이언티픽	C79-500
원심 분리기	밀리포어 시그마	M7157	모델: Eppendorf 5415C
디엠소	시그마-알드리치	472301-100ML
포도당 일수화물	시그마-알드리치	Y0001745
HEPES 버퍼 (1m)	피셔 사이언티픽	전화: 50-751-7290	4 °C에서 보관하십시오
아이오노마이신 칼슘 염	EMD Milipore 공사	407952-1MG	DMSO에 용해하여 2mM에 도달합니다. -20 °C에서 보관하십시오
케이클	피셔 사이언티픽	P330-500
마그네슘SO4	피셔 사이언티픽	M65-500
마이크로 원심분리기 튜브	피셔 사이언티픽	02-681-5
염화나트륨	피셔 사이언티픽	시즌 271-500
Synergy HFM 마이크로플레이트 리더	(주)바이오텍
ACD의 전혈	젠바이오		사용하기 전에 4 °C에서 보관하고 37 °C로 데우십시오

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