Annexin V 결합 분석: 포스파티딜세린 라벨링을 통해 세포사멸 적혈구를 식별하는 형광 기반 기술

초록

출처: Bigdelou, P., et al. 칼슘 이오노포어를 이용한 적혈구의 홍반증 유도. J. Vis. 특급. (2020년)

이 비디오에서는 형광 Annexin V 염색을 사용하여 적혈구 프로그래밍된 세포 사멸의 정도를 측정하기 위한 Annexin V 결합 분석을 시연합니다. 세포사멸 적혈구는 세포막의 내부에서 외부 소엽으로 포스파티딜세린 전좌를 보여주며, 이로 인해 형광단 태그가 지정된 Annexin V가 전좌된 포스파티딜세린에 결합하여 형광 신호를 방출합니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. Annexin-V 결합 분석

1. 1mg의 이오노마이신 칼슘 염을 630μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 최종 농도 2mM에 도달합니다. 부분 표본은 -20 °C에서 보관하십시오.
2. 0.4% 헤마토크릿 1mL를 복용하고 2mM 이오노마이신 0.5μL를 첨가하여 최종 농도 1μM에 도달합니다.37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
3. 이오노마이신 처리 및 처리되지 않은 헤마토크릿을 RT에서 5분 동안 700 x g에서 원심분리하고 상등액을 제거하여 세포 펠릿이 튜브 바닥에 남도록 합니다.
4. 세포 펠릿을 1.5mL의 Ringer 용액에 현탁시키고 실온에서 5분 동안 700 x g에서 원심분리한 다음 상등액을 버리고 Ringer 용액으로 세포를 3x 세척합니다.
5. ionomycin 처리 및 처리되지 않은 적혈구 세포 펠릿을 1mL의 1x 결합 완충액에 재현탁합니다.
6. 5x annexin V 결합 완충액 2mL를 인산염 완충 식염수(PBS) 8mL에 희석하여 1x 결합 완충액을 얻습니다.
7. 결합 완충액에 235μL의 세포 현탁액을 넣고 15μL의 Annexin V-Alexa Flour 488 접합체를 추가합니다.
8. 어두운 곳에서 실온(RT)에서 20분 동안 세포를 배양합니다. 상온에서 5분 동안 700 x g에서 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다.
9. 세포 펠릿을 결합 완충액 1.5mL에 현탁시키고 RT에서 5분 동안 700 x g에서 원심분리한 후 상층액을 제거하여 1x 결합 완충액으로 세포를 2x 세척합니다.
10. 유세포 분석을 위해 250 μL의 1x 결합 완충액에 세포 펠릿을 재현탁합니다.

2. 유세포 분석

1. 200 μL의 annexin V-stained erythrocytes를 유세포 분석과 호환되는 1 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다.
2. 유세포 분석 소프트웨어에 로그인하고 새 실험 버튼을 클릭합니다. 새 튜브 버튼을 클릭합니다. 글로벌 시트를 선택하고 적용 분석을 선택하여 여기 파장이 488nm이고 방출 파장이 530nm인 형광 강도를 측정합니다.
3. 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석을 위해 수집할 세포 수를 20,000개로 설정합니다.
4. 원하는 튜브를 선택하고 로드 버튼을 클릭합니다. 기록 버튼을 클릭하면 전방 산란 및 측면 산란 측정을 수행할 수 있습니다. 모든 샘플에 대해 반복합니다.
5. 시편(specimen) 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Apply batch analysis(배치 해석 적용)를 클릭하여 결과 파일을 생성합니다.
6. 표본 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 FSC 파일 생성을 클릭합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Annexin V Alexa Fluor 488 - 세포사멸 키트	피셔 사이언티픽	A10788	4 °C에서 보관하십시오
BD FACSaria II 유세포 분석기	BD 바이오사이언스	643177
아이오노마이신 칼슘 염	EMD Milipore 공사	407952-1MG	DMSO에 용해하여 2mM에 도달합니다. -20 °C에서 보관하십시오
원심 분리기	밀리포어 시그마	M7157	모델: Eppendorf 5415C
일회용 둥근 바닥 유세포 분석 튜브	폭스바겐	VWRU47729-566
염화칼슘2	피셔 사이언티픽	C79-500
디피에스	VWR 생명과학	SH30028.02
마이크로 원심분리기 튜브	피셔 사이언티픽	02-681-5
ACD의 전혈	젠바이오		사용하기 전에 4 °C에서 보관하고 37 °C로 데우십시오