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참고: 독자를 위한 편리한 참고 자료로, 다음 방법론은 생물학적 분석 실행에서 20개의 실험 샘플에서 Fe 생체이용률을 측정하는 데 필요한 특정 배양 조건 및 재료와 필요한 품질 관리를 설명합니다. 이 용량을 초과하여 시료 수를 늘리는 것은 생물학적 분석 내에서 다양한 세포 배양 및 체외 분해 단계에 필요한 시간 때문에 권장되지 않습니다.
1. 샘플의 양 선택
- 고체 또는 액체 식품의 경우, 테스트할 샘플을 대표하는 것으로 간주될 수 있는 식품의 양을 결정하십시오.
- 콩 품종의 Fe 생체 이용률을 테스트할 때 100-150g의 콩 종자를 사용하고 이 양을 균질한 샘플로 처리합니다.
- 강화 주스, 유제품 및 스포츠 음료와 같은 액체 샘플의 경우 샘플링 전에 식품이 잘 혼합되었는지 확인하십시오.
참고: 위에서 언급한 콩 종자 재료의 양은 이 주요 작물의 종자 간의 고유한 차이를 설명하는 데 필수적입니다.
2. 샘플 준비
- 가공하기 전에 증류수 탈이온수로 식품 샘플의 토양과 먼지를 헹굽니다.
- 조리 방법 및 밀링과 같은 실험 목표에 따라 적절한 양의 샘플을 처리합니다.
알림: 요리 및 가공의 경우 잠재적인 오염원 Fe가 아닌 조리기구 및 장비를 사용하는 것이 중요합니다. 스테인레스 스틸 장비는 오염되지 않습니다. 그러나 석재 분쇄기, 주철 조리기구 및 Fe를 함유한 스테인리스강이 아닌 장비와 같은 장비는 상당한 양의 오염 물질 Fe를 추가할 수 있습니다. 표준 스테인리스 스틸 커피 그라인더는 종종 연삭에 적합합니다.
- 동결 건조하고 균질한 분말로 분쇄합니다.
참고: 일단 균질화되면, 연구에 따르면 측정되는 각 식품에 대해 세 가지 독립적인 분석 반복이 적절합니다.
- 시료 균질성을 달성하기 어려운 경우 제품의 배합 또는 가공을 수정하십시오. 이것이 가능하지 않은 경우 비균질성이 심각하지 않은 경우 복제를 추가합니다.
- 대부분의 균질한 고체 식품의 경우, 복제당 0.5g의 동결건조 샘플을 사용하십시오. 필요한 경우 반복당 최대 1.0g의 샘플을 사용하되 0.5g 이상이 반응 정도에 이점이 있는지 확인합니다.
참고: 0.5g 이상의 고형 식품은 투석막을 막을 수 있습니다(아래 참조).
- 1-2mL의 액체 샘플을 사용합니다.
메모: 동결 건조는 종종 액체 샘플에 필요하지 않습니다.
3. Caco-2 세포 배양
- 주식 문화
- 인증된 공급업체로부터 Caco-2 셀을 구입하십시오.
- 25mM HEPES(pH 7.2), 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 항생제-항진균 용액이 보충된 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle's Medium)을 사용하여 5% CO2 공기 대기(일정한 습도)의 인큐베이터에서 37°C의 스톡 바이알에서 세포를 배양합니다.
- 일반적으로 배양 7-10일 후에 충분한 세포를 사용할 수 있게 되면 30,000 cells/cm2의 밀도로 콜라겐이 코팅되지 않은 플라스크에 세포를 파종합니다.
- 사용 가능한 셀의 수와 멀티웰 플레이트를 파종하는 데 필요한 플라스크 크기를 선택합니다.
참고: 일반적으로 T225(225 cm2) 플라스크는 생물학적 분석당 11개의 멀티웰(6-well, 9.66 cm2/well) 플레이트(샘플 비교용 10개 플레이트, 품질 관리용 1개 플레이트)가 사용되는 실험에 가장 적합합니다.
- 7일 동안 플라스크에서 세포를 성장시키고 격일로 배지를 교체하고 7일째에 멀티웰 플레이트를 파종하는 데 사용합니다.
참고: 세포가 스톡 배양에서 시작되어 일련의 실험에 사용될 때부터 10-15개 이하의 계대 범위를 사용하는 것이 좋습니다. 세포 배양 계대는 광범위한 계대가 세포주에 적응적 변화를 일으킬 수 있으며, 이에 따라 모델 반응의 가변성을 초래할 수 있으므로 제한해야 합니다.
- 멀티웰 플레이트에서 세포 배양
- 50,000 cells/cm2의 밀도로 Caco-2 세포를 6-well 콜라겐 코팅 플레이트에 파종합니다.
참고: 이 단계는 일반적으로 수요일에 수행하는 경우 가장 잘 작동합니다. 다음 단계를 통해 이 요일이 최적의 이유를 분명히 알 수 있습니다.
- 25mM HEPES(pH 7.2), 10%(v/v) FBS 및 1% 항생제-항진균 용액이 보충된 DMEM을 사용하여 5% CO2 공기 대기(일정한 습도)의 인큐베이터에서 37°C에서 12일 동안 세포를 성장시킵니다.
참고: 세포 단층을 12일 이상 배양하면 세포가 과도하게 증식할 수 있습니다. 이전 연구에서는 이러한 조건에서 파종 후 12일이 지나면 세포 단층이 성숙하고 플레이트에 잘 부착되며 반응의 일관성이 최적임을 분명히 보여주었습니다. 최대 19-21일과 같이 세포를 더 오래 성장시키면 세포가 과도하게 성장하고 배지에 영양분이 급격히 고갈되어 건강에 해로운 단층이 생성됩니다.
- 12일 동안 일관된 일일 일정에 따라 최소 2일마다 매체를 변경합니다.
- 파종 후 12일째에 배양 배지를 10mM PIPES(피페라진-N,N'-비스-[2-에탄술폰산]), 1% 항생제-항진균 용액, 하이드로코르티손(4mg/L), 인슐린(5mg/L), 셀레늄(5μg/L), 트리요오드티로닌(34μg/L) 및 표피 성장 인자(20μg/L)가 보충된 2mL의 최소 필수 배지(MEM[pH 7])로 교체합니다.
참고: 시드가 수요일에 시작된 경우 12번째 날은 월요일이 됩니다.
- 다음 날(즉, 13일차)에 MEM을 제거하고 1mL의 MEM(pH 7)으로 교체하십시오.
참고: 이 단계는 화요일에 발생합니다. 이날은 생물학적 분석이 시작되는 날입니다. 따라서 13일 일정은 일관된 주간 일정의 이점을 제공하여 동일한 평일에 일관되게 생물학적 분석을 수행할 수 있습니다.
4. 체외 소화
- 인서트 링의 준비
- 산 세척 투석막이 장착된 실리콘 O-링을 사용하여 멸균된 인서트 링을 만듭니다(그림 1A).
참고: 생물학적 분석 당일의 1일 전(즉, 월요일, 12일)에 삽입물을 준비하고 사용할 준비가 될 때까지 4°C의 18MΩ 물에 보관하십시오.
- 생물학적 분석 당일(화요일, 13일차)에 냉장고에서 삽입물을 제거하고 배수한 후 물을 0.5M HCl로 교체하십시오. 사용하기 전에 최소 1시간 동안 층류 후드에 넣어 실온에 두십시오.
참고: 이 단계는 배양 플레이트에서 MEM을 제거하기 전에 수행해야 합니다. 멤브레인의 산 세척은 오염 가능성이 있는 Fe를 제거하는 역할을 하고 삽입 링과 멤브레인을 살균합니다.
- 인서트에서 0.5M HCl을 배출하고 멸균 18MΩ 물로 헹굽니다. 사용할 준비가 될 때까지 층류 후드에 넣어 실온의 멸균 18MΩ 물에 보관하십시오.
- Caco-2 셀이 있는 6웰 플레이트의 각 웰에 링을 삽입하여 2개의 챔버 시스템을 만듭니다. 인서트가 있는 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
참고: 이 단계는 각 웰에 새로운 1.0mL의 MEM을 추가한 직후에 수행해야 합니다(3.2.5단계 참조).
- 펩신 용액의 제조
- 실험 당일, 0.145g의 펩신을 0.1M HCl 50mL에 용해시켜 펩신 용액을 준비합니다. 플랫폼 셰이커에서 용액을 실온에서 30분 동안 부드럽게 흔듭니다.
- 췌장-담즙 용액의 제조
- 실험과 같은 날, 2.1g의 NaHCO3 를 18MΩ 물 250mL에 용해시켜 0.1M NaHCO3를 제조한다.
- 0.1M NaHCO 3 175mL에 판크레아틴 0.35g과 담즙 추출물 2.1g을 혼합합니다.
- 판크레아틴과 담즙 추출물이 가용화되면 약한 양이온 교환 수지 87.5g(재료 표 참조)을 넣고 실온에서 30분 동안 흔들어 혼합합니다.
- 슬러리를 큰 기둥에 붓고 용리액을 수집합니다.
- 추가로 70mL의 0.1M NaHCO3로 컬럼을 용리하여 이 부피를 판크레아틴 담즙 용액에 수집합니다.
참고: 수지의 목적은 췌장-담즙 추출물에서 흔히 발견되는 오염 물질 Fe를 제거하는 것입니다.
- 체외 소화를 시작합니다.
- 멸균 50mL 원심분리 튜브(폴리프로필렌)에서 샘플의 무게를 측정한 다음 140mM NaCl 및 5mM KCl을 함유한 pH 2의 생리식염수 10mL를 추가합니다.
- 준비된 돼지 펩신 용액 0.5mL를 검체에 첨가하여 위 분해 과정을 시작하고 37°C에서 1시간 동안 낮고 부드러운 설정으로 흔들리는 셰이커에서 배양합니다.
- 이 기간이 지나면 1.0 M NaHCO3 로 pH를 5.5-6.0으로 조정하여 각 샘플의 장 소화 과정을 시작합니다.
- 각 샘플 튜브에 판크레아틴-담즙 용액 2.5mL를 추가하고 1.0M NaHCO3로 pH를 6.9-7.0으로 조정합니다.
- pH가 조정되면 140mM NaCl, 5mM KCl(pH 6.7) 용액을 사용하여 각 튜브의 부피를 균등화하고 목표 값 15g.
로 튜브의 무게를 측정합니다.
참고: 일부 식품의 경우 식품의 완충 용량에 따라 총 부피를 16g 또는 17g으로 가져와야 할 수도 있습니다.
- 각 장 분해물 1.5mL를 Caco-2 세포가 포함된 6웰 배양 플레이트의 해당 웰의 상부 챔버(즉, 투석막이 있는 삽입 고리 포함)로 옮깁니다(그림 1B).
- 플레이트 커버를 교체하고 37°C(5% CO2 공기 대기)의 로킹 셰이커에서 2시간 동안 6회 진동/분으로 배양합니다.
- 다이제스트가 있는 삽입 링을 제거하고 각 웰에 1mL의 MEM(pH 7)을 추가로 추가합니다.
- 세포 배양 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5% CO2 공기 대기)에 다시 22시간 동안 다시 넣습니다.
- 22시간 후 세포 배양 배지를 제거하고 세포 단층에 18MΩ 물 2.0mL를 추가합니다.
참고: 물은 세포를 삼투압으로 용해시킵니다.
- 전체 세포 용해물을 표준 폴리프로필렌 마이크로 원심분리기 튜브 또는 이와 유사한 것으로 수확하여 후속 세포 단백질 및 세포 페리틴 분석을 수행합니다.
