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참고: 모든 절차는 송풍기를 켜고 조명을 끈 상태에서 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.
1. 재료 준비
참고: 모든 재료는 재료 표에 나열되어 있습니다.
- 표 1에 따라 배지 1, 원심분리 매체 2 및 형광 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose(2-NBDG 또는 FD-glucose)의 저장 및 작업 용액을 Class II 생물 안전 캐비닛에 준비합니다. 후드 아래의 모든 조명을 꺼서 실험 내내 FD-포도당을 빛으로부터 보호하십시오.
- 즉시 사용 가능한 세포 배양 시약을 사용하십시오: 트립신-EDTA, 인산염 완충 식염수(PBS), 무포도당 및 페놀 무함유 페놀 레드-프리 Dulbecco's Modified Eagle Medium(이하, 무포도당 DMEM).
- 방사성 면역침전 분석(RIPA) 용해 완충액 20mL를 사용합니다.
참고: 다음 섹션에서는 인슐린 자극이 있는 경우와 없는 경우의 3T3-L1 섬유아세포에서 서로 다른 FD-포도당 용량의 세포 외 고갈 및 세포 내 흡수를 비교합니다(그림 1).
2. 3T3-L1 세포 배양 및 유지 관리
2- 개의 96웰 플레이트에서 20mL의 Medium 1에 희석된 1 x 106 세포를 도금하여 3T3-L1 마우스 섬유아세포를 배양합니다. 웰당 100μL의 세포 현탁액을 플레이트화하여 혼합을 통해 이 현탁액의 균질성을 유지합니다. 약 70%-80% 포화도가 될 때까지 배지를 변경하지 않고 37°C 인큐베이터(5% CO2 및 95% 습도)에서 48시간 동안 세포를 성장시킵니다.
- 48시간 동안 동일한 배지에서 세포를 배양하여 세포가 합류하고 단식하도록 유지합니다. 원하는 공복 이화 상태에 따라 배양 시간을 24-72시간으로 변경합니다.
3. 3T3-L1 셀의 고갈
- 96웰 플레이트에 있는 세포의 디캔트 배지. 멸균 종이 타월을 사용하여 남은 액체를 흡수합니다.
- 웰당 100μL의 PBS로 96웰 플레이트를 헹구고 멸균 종이 타월로 남은 액체를 흡수합니다.
- 웰당 100μL의 무포도당 DMEM을 추가하고 40분 동안 배양합니다. 세포 유형, 자극 및 원하는 공복 수준에 따라 배양 시간을 조정합니다.
참고: 부화 시기는 계절에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다.
4. 농도가 다른 FD- 포도당 용액의 제조
참고: 그림 1의 실험은 인슐린을 자극하거나 자극하지 않은 세포외 및 세포간 매체를 조사합니다.
- 각 자극 조건에 대해 8개의 반복(96웰 플레이트의 한 행)을 사용합니다. 따라서, 각 자극 조건(표 2 및 하기 참조)에 대해 1mL를 준비한다.
- 인슐린이 없는 8가지 자극 조건을 사용합니다: 하나의 96-well 플레이트에서 2.5 μg/mL, 1 μg/mL, 0.5 μg/mL, 0.2 μg/mL, 0.1 μg/mL, 0.05 μg/mL 및 0 μg/mL(FD-포도당을 사용하지 않은 대조군)의 FD-포도당.
- 인슐린(10 μg/mL, 최종 농도)과 함께 8가지 자극 조건을 사용합니다: 다른 96-well 플레이트에서 2.5 μg/mL, 1 μg/mL, 0.5 μg/mL, 0.2 μg/mL, 0.1 μg/mL, 0.05 μg/mL 및 0 μg/mL(FD-글루코스 없이 대조군)의 FD-포도당.
- 자극 조건을 준비하기 위해 1μL의 5mg/mL FD-포도당 작업 용액(표 1)을 999μL의 포도당이 없는 DMEM에 희석하여 1mL의 작업 원료 용액(1:1000 희석 또는 5μg/mL)을 얻습니다.
- 이 작업 원료 용액을 사용하여 조명이 없는 생물 안전 캐비닛에서 실험하기 직전에 2mL 튜브에서 2.5μg/mL, 1μg/mL, 0.5μg/mL, 0.2μg/mL, 0.1μg/mL 및 0.05μg/mL(표 2)를 얻기 위해 FD-포도당의 1:2000, 1:5000, 1:10,000, 1:25,000, 1:50,000, 1:50,000, 1:50,000, 1:50,000, 1:50,000 및 1:100,000 희석
액을 준비합니다.
- 4.4단계를 반복하고 위에 지정된 각 조건에 1μL의 인슐린(10mg/mL, 최종 농도)을 추가합니다.
참고: 이 샘플에서 인슐린의 최종 농도는 10μg/mL = 1.7nmol/mL입니다. 균질화를 달성하려면 다른 용액을 추가하기 전에 튜브에 인슐린을 추가하십시오.
5. 굶주린 3T3-L1 세포 치료
- 40분 배양 후 각 웰에서 포도당이 없는 DMEM을 96웰 플레이트의 디캔팅하고 멸균 종이 타월로 남은 액체를 흡수합니다.
- 위에서 설명한 다양한 처리 조건에서 각각 100μL(웰당)를 하나의 컬럼을 따라 웰에 추가하고, 동일한 처리 조건에서 100μL(웰당)를 두 96웰 플레이트의 행(8회 반복)을 따라 웰에 추가합니다. 인슐린이 있는 상태와 없는 상태를 활용한 플레이트에 라벨을 붙입니다. glucose-free DMEM만 대조군 웰에 추가합니다(n = 8).
- 어두운 곳에서 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO2 및 95% 습도)에서 40분 동안 플레이트를 배양합니다.
6. 자극된 3T3-L1 세포에 대한 세포 외 및 세포 간 측정
- 세포를 40분 동안 자극한 후 두 플레이트의 자극 매체를 동일한 실험 레이아웃을 유지하면서 새로운 96웰 플레이트로 이동합니다.
- 원래의 자극된 96웰 플레이트에서 남아 있는 용액을 멸균 종이 타월에 세포로 디캔팅합니다.
- 선택적으로 PBS로 셀을 세척합니다. PBS를 제거하고 멸균 종이 타월에 남아 있는 용액을 디캔팅합니다.
- 각 웰에 100μL의 RIPA 용해 완충액을 추가합니다. 선택적으로, 단백질을 보호하기 위해 RIPA 완충액에 프로테아제 억제제를 추가합니다. RIPA가 포함된 플레이트를 셰이커에 30분 동안 놓습니다.
- 마이크로플레이트 리더(Table of Materials)를 사용하여 먼저 세포외 FD-포도당을 포함하는 배지에서 각각 485 및 535nm의 여기(excitation) 및 방출(Em) 파장에서 형광을 측정한 다음 30분 배양 종료 시 RIPA 용해된 세포가 있는 플레이트에서 형광을 측정합니다(단계 6.4 참조).
표 1: 배양 배지 및 FD-포도당 용액의 준비.
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| 솔루션/중간 | 구성 요소 |
| 에탄올 : DMSO (1 : 1 / v / v) | 1-1.5 mL 튜브에 에탄올(200 μL) 및 DMSO(200 μL), 세포 배양 등급 에탄올 및 DMSO 사용 |
| 중간 1 | DMEM(89mL), 페니실린/스트렙토마이신(1%)(1mL) 및 송아지 혈청(10%)(10mL)을 멸균 50mL 튜브에 담았습니다 |
| 원심분리 매체 2 | DMEM(89mL), 페니실린/스트렙토마이신(1%)(1mL) 및 소 혈청(10%)(10mL)을 멸균 50mL 튜브에 담았습니다 |
| 보관 FD-포도당 용액 5mg/mL(14.5mM) | FD 포도당 (1 mg) 및 에탄올 : 0.5 mL 튜브에 DMSO (1 : 1 / v / v) (200 μL); -80 °C에서 우선적으로 아르곤 또는 질소 분위기에서 보관하십시오 |
| 작동 FD- 포도당 용액 5 μg / mL (14.5 mM) | 저장 FD 포도당 해결책 5 mg/mL (1 μL), 포도당 자유로운 DMEM (999 μL); 실험 전에 즉시 준비하십시오. |
표 2: 그림 1에 표시된 실험을 위한 다양한 농도의 FD-포도당 용액 준비.
호
개
호
년
명
명
명
명
명
명
명
명
개
의
분
분
| 희석 | 제어 | 1:2x103 | 1:5x103 | 1:1x104 | 1:2.5x104 | 1:5x104 | 1:1x105 |
| 농도 (μg/mL) | 0 | 2.5 | 1 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 0.05 |
| 무포도당 DMEM(μL) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| FD 포도당 5 μg/mL (μL) | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
