In vitro glucose depletion assay: 세포외 포도당 고갈 측정을 통해 세포 포도당 흡수를 정량화하는 형광 기반 방법

초록

출처: Kumar, S. B. et al., 생체 외 세포 및 조직에서 포도당 흡수의 간접 측정으로서의 세포외 포도당 고갈.J. Vis. 특급(2022년)

이 동영상은 세포 내 포도당 흡수를 간접적으로 측정하는 체외 분석을 보여줍니다. 이 분석은 형광 표지된 포도당 유사체를 사용하여 세포 외 포도당 고갈과 세포 내 포도당 흡수 사이의 상관 관계를 확립합니다.

프로토콜

참고: 모든 절차는 송풍기를 켜고 조명을 끈 상태에서 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.

1. 재료 준비

참고: 모든 재료는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 표 1에 따라 배지 1, 원심분리 매체 2 및 형광 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose(2-NBDG 또는 FD-glucose)의 저장 및 작업 용액을 Class II 생물 안전 캐비닛에 준비합니다. 후드 아래의 모든 조명을 꺼서 실험 내내 FD-포도당을 빛으로부터 보호하십시오.
2. 즉시 사용 가능한 세포 배양 시약을 사용하십시오: 트립신-EDTA, 인산염 완충 식염수(PBS), 무포도당 및 페놀 무함유 페놀 레드-프리 Dulbecco's Modified Eagle Medium(이하, 무포도당 DMEM).
3. 방사성 면역침전 분석(RIPA) 용해 완충액 20mL를 사용합니다.
   참고: 다음 섹션에서는 인슐린 자극이 있는 경우와 없는 경우의 3T3-L1 섬유아세포에서 서로 다른 FD-포도당 용량의 세포 외 고갈 및 세포 내 흡수를 비교합니다(그림 1).

2. 3T3-L1 세포 배양 및 유지 관리

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1. 개의 96웰 플레이트에서 20mL의 Medium 1에 희석된 1 x 10⁶ 세포를 도금하여 3T3-L1 마우스 섬유아세포를 배양합니다. 웰당 100μL의 세포 현탁액을 플레이트화하여 혼합을 통해 이 현탁액의 균질성을 유지합니다. 약 70%-80% 포화도가 될 때까지 배지를 변경하지 않고 37°C 인큐베이터(5% CO₂ 및 95% 습도)에서 48시간 동안 세포를 성장시킵니다.
2. 48시간 동안 동일한 배지에서 세포를 배양하여 세포가 합류하고 단식하도록 유지합니다. 원하는 공복 이화 상태에 따라 배양 시간을 24-72시간으로 변경합니다.

3. 3T3-L1 셀의 고갈

1. 96웰 플레이트에 있는 세포의 디캔트 배지. 멸균 종이 타월을 사용하여 남은 액체를 흡수합니다.
2. 웰당 100μL의 PBS로 96웰 플레이트를 헹구고 멸균 종이 타월로 남은 액체를 흡수합니다.
3. 웰당 100μL의 무포도당 DMEM을 추가하고 40분 동안 배양합니다. 세포 유형, 자극 및 원하는 공복 수준에 따라 배양 시간을 조정합니다.
   참고: 부화 시기는 계절에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다.

4. 농도가 다른 FD- 포도당 용액의 제조

참고: 그림 1의 실험은 인슐린을 자극하거나 자극하지 않은 세포외 및 세포간 매체를 조사합니다.

1. 각 자극 조건에 대해 8개의 반복(96웰 플레이트의 한 행)을 사용합니다. 따라서, 각 자극 조건(표 2 및 하기 참조)에 대해 1mL를 준비한다.
2. 인슐린이 없는 8가지 자극 조건을 사용합니다: 하나의 96-well 플레이트에서 2.5 μg/mL, 1 μg/mL, 0.5 μg/mL, 0.2 μg/mL, 0.1 μg/mL, 0.05 μg/mL 및 0 μg/mL(FD-포도당을 사용하지 않은 대조군)의 FD-포도당.
3. 인슐린(10 μg/mL, 최종 농도)과 함께 8가지 자극 조건을 사용합니다: 다른 96-well 플레이트에서 2.5 μg/mL, 1 μg/mL, 0.5 μg/mL, 0.2 μg/mL, 0.1 μg/mL, 0.05 μg/mL 및 0 μg/mL(FD-글루코스 없이 대조군)의 FD-포도당.
4. 자극 조건을 준비하기 위해 1μL의 5mg/mL FD-포도당 작업 용액(표 1)을 999μL의 포도당이 없는 DMEM에 희석하여 1mL의 작업 원료 용액(1:1000 희석 또는 5μg/mL)을 얻습니다.
   1. 이 작업 원료 용액을 사용하여 조명이 없는 생물 안전 캐비닛에서 실험하기 직전에 2mL 튜브에서 2.5μg/mL, 1μg/mL, 0.5μg/mL, 0.2μg/mL, 0.1μg/mL 및 0.05μg/mL(표 2)를 얻기 위해 FD-포도당의 1:2000, 1:5000, 1:10,000, 1:25,000, 1:50,000, 1:50,000, 1:50,000, 1:50,000, 1:50,000 및 1:100,000 희석
   액을 준비합니다.
5. 4.4단계를 반복하고 위에 지정된 각 조건에 1μL의 인슐린(10mg/mL, 최종 농도)을 추가합니다.
   참고: 이 샘플에서 인슐린의 최종 농도는 10μg/mL = 1.7nmol/mL입니다. 균질화를 달성하려면 다른 용액을 추가하기 전에 튜브에 인슐린을 추가하십시오.

5. 굶주린 3T3-L1 세포 치료

1. 40분 배양 후 각 웰에서 포도당이 없는 DMEM을 96웰 플레이트의 디캔팅하고 멸균 종이 타월로 남은 액체를 흡수합니다.
2. 위에서 설명한 다양한 처리 조건에서 각각 100μL(웰당)를 하나의 컬럼을 따라 웰에 추가하고, 동일한 처리 조건에서 100μL(웰당)를 두 96웰 플레이트의 행(8회 반복)을 따라 웰에 추가합니다. 인슐린이 있는 상태와 없는 상태를 활용한 플레이트에 라벨을 붙입니다. glucose-free DMEM만 대조군 웰에 추가합니다(n = 8).
3. 어두운 곳에서 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO₂ 및 95% 습도)에서 40분 동안 플레이트를 배양합니다.

6. 자극된 3T3-L1 세포에 대한 세포 외 및 세포 간 측정

1. 세포를 40분 동안 자극한 후 두 플레이트의 자극 매체를 동일한 실험 레이아웃을 유지하면서 새로운 96웰 플레이트로 이동합니다.
2. 원래의 자극된 96웰 플레이트에서 남아 있는 용액을 멸균 종이 타월에 세포로 디캔팅합니다.
3. 선택적으로 PBS로 셀을 세척합니다. PBS를 제거하고 멸균 종이 타월에 남아 있는 용액을 디캔팅합니다.
4. 각 웰에 100μL의 RIPA 용해 완충액을 추가합니다. 선택적으로, 단백질을 보호하기 위해 RIPA 완충액에 프로테아제 억제제를 추가합니다. RIPA가 포함된 플레이트를 셰이커에 30분 동안 놓습니다.
5. 마이크로플레이트 리더(Table of Materials)를 사용하여 먼저 세포외 FD-포도당을 포함하는 배지에서 각각 485 및 535nm의 여기(excitation) 및 방출(Em) 파장에서 형광을 측정한 다음 30분 배양 종료 시 RIPA 용해된 세포가 있는 플레이트에서 형광을 측정합니다(단계 6.4 참조).

표 1: 배양 배지 및 FD-포도당 용액의 준비.

. . .

솔루션/중간	구성 요소
에탄올 : DMSO (1 : 1 / v / v)	1-1.5 mL 튜브에 에탄올(200 μL) 및 DMSO(200 μL), 세포 배양 등급 에탄올 및 DMSO 사용
중간 1	DMEM(89mL), 페니실린/스트렙토마이신(1%)(1mL) 및 송아지 혈청(10%)(10mL)을 멸균 50mL 튜브에 담았습니다
원심분리 매체 2	DMEM(89mL), 페니실린/스트렙토마이신(1%)(1mL) 및 소 혈청(10%)(10mL)을 멸균 50mL 튜브에 담았습니다
보관 FD-포도당 용액 5mg/mL(14.5mM)	FD 포도당 (1 mg) 및 에탄올 : 0.5 mL 튜브에 DMSO (1 : 1 / v / v) (200 μL); -80 °C에서 우선적으로 아르곤 또는 질소 분위기에서 보관하십시오
작동 FD- 포도당 용액 5 μg / mL (14.5 mM)	저장 FD 포도당 해결책 5 mg/mL (1 μL), 포도당 자유로운 DMEM (999 μL); 실험 전에 즉시 준비하십시오.

표 2: 그림 1에 표시된 실험을 위한 다양한 농도의 FD-포도당 용액 준비.

호 개 호 년 명 명 명 명 명 명 명 명 개 의 분 분

희석	제어	1:2x103	1:5x103	1:1x104	1:2.5x104	1:5x104	1:1x105
농도 (μg/mL)	0	2.5	1	0.5	0.2	0.1	0.05
무포도당 DMEM(μL)	1000	500	800	900	960	980	990
FD 포도당 5 μg/mL (μL)	0	500	200	100	40	20	10

결과

그림 1: 세포외 FD-포도당의 고갈은 체외에서 세포내 흡수와 상관관계가 있습니다.3T3-L1 지방세포를 인슐린이 있거나 없는 FD-포도당의 농도가 다른 상태로 배양하기 전에 포도당이 없는 배지에서 40분 동안 배양했습니다(1.7mM, 40분 배양). (가, 나) FD-포도당(A) 및 세포외 FD-포도당 고갈(B)을 조절(즉, 인슐린 없이)(부화한 막대) 및 인슐린 자극 세포(검은색 막대)의 용량 의존적 흡수. FD-포도당 흡수는 단백질 농도에 의해 정규화되었습니다. 데이터는 FD-포도당 없이 배양된 대조군에서 측정된 값의 %로 표시됩니다(조건별 평균 SD, n = 8). 유의성은 쌍을 이루지 않은 t-검정으로 조...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3T3-L1 마우스 섬유아세포	증권 시세	CL-173	세포주
96웰 플레이트	송골매	353227	플라스틱 도자기
BioTek Synergy H1 모듈식 멀티모드 마이크로플레이트 리더(Fisher Scientific, 미국)	Fisher Scientific, 미국	비-SHT	장치
소 세럼	Gibco/써모피셔	제161790-060	세포 배양
송아지 세럼	Gibco/써모피셔	26010-066	세포 배양
세포 배양기	견적	시리즈 II 워터 재킷	장치
디메틸설폭사이드(DMSO)	시그마 라이프사이언	D2650-100mL	시약
둘베코의 변형된 독수리 매체	Gibco/써모피셔	11965-092	세포 배양
에탄올	시그마 알드리치	E7023-500mL	시약
형광 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)	시그마	72987-1MG	시험
무포도당 및 페놀 레드 무함유 DMEM	Gibco/써모피셔	A14430-01	세포 배양
인간 인슐린 10 mg/mL	밀리포어시그마	고양이 N 91077C	시약
페니실린/스트렙토마이신(P/S)	Gibco/써모피셔	15140-122	세포 배양
인산염 완충 용액	시그마-알드리치	DA537-500 밀리리터	세포 배양
방사성 면역침전 분석 용해 완충액	산타 크루즈 생명 공학	사우스캐롤라이나-24948	시험
트립신-EDTA (0.05%)	Gibco/써모피셔	제25300-054	세포 배양

표시기 호 년 스 년 (영문) 년 호