In vitro glucose depletion assay: 세포외 포도당 고갈 측정을 통해 세포 포도당 흡수를 정량화하는 형광 기반 방법

Abstract

출처: Kumar, S. B. et al., 생체 외 세포 및 조직에서 포도당 흡수의 간접 측정으로서의 세포외 포도당 고갈.J. Vis. 특급(2022년)

이 동영상은 세포 내 포도당 흡수를 간접적으로 측정하는 체외 분석을 보여줍니다. 이 분석은 형광 표지된 포도당 유사체를 사용하여 세포 외 포도당 고갈과 세포 내 포도당 흡수 사이의 상관 관계를 확립합니다.

Protocol

참고: 모든 절차는 송풍기를 켜고 조명을 끈 상태에서 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.

1. 재료 준비

참고: 모든 재료는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 표 1에 따라 배지 1, 원심분리 매체 2 및 형광 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose(2-NBDG 또는 FD-glucose)의 저장 및 작업 용액을 Class II 생물 안전 캐비닛에 준비합니다. 후드 아래의 모든 조명을 꺼서 실험 내내 FD-포도당을 빛으로부터 보호하십시오.
2. 즉시 사용 가능한 세포 배양 시약을 사용하십시오: 트립신-EDTA, 인산염 완충 식염수(PBS), 무포도당 및 페놀 무함유 페놀 레드-프리 Dulbecco's Modified Eagle Medium(이하, 무포도당 DMEM).
3. 방사성 면역침전 분석(RIPA) 용해 완충액 20mL를 사용합니다.
   참고: 다음 섹션에서는 인슐린 자극이 있는 경우와 없는 경우의 3....

Results

그림 1: 세포외 FD-포도당의 고갈은 체외에서 세포내 흡수와 상관관계가 있습니다.3T3-L1 지방세포를 인슐린이 있거나 없는 FD-포도당의 농도가 다른 상태로 배양하기 전에 포도당이 없는 배지에서 40분 동안 배양했습니다(1.7mM, 40분 배양). (가, 나) FD-포도당(A) 및 세포외 FD-포도당 고갈(B)을 조절(즉, 인슐린 없이)(부화한 막대) 및 인슐린 자극 세포(검은색 막대)의 용량 의존적 흡수. FD-포도당 흡수는 단백질 농도에 의해 정규화되었습니다. 데이터는 FD-포도당 없이 배양된 대조군에서 측정된 값의 %로 표시됩니다(조건별 평균 SD, n = 8). 유의성은 쌍을 이루지 않은 t-검정으로 조.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3T3-L1 마우스 섬유아세포	증권 시세	CL-173	세포주
96웰 플레이트	송골매	353227	플라스틱 도자기
BioTek Synergy H1 모듈식 멀티모드 마이크로플레이트 리더(Fisher Scientific, 미국)	Fisher Scientific, 미국	비-SHT	장치
소 세럼	Gibco/써모피셔	제161790-060	세포 배양
송아지 세럼	Gibco/써모피셔	26010-066	세포 배양
세포 배양기	견적	시리즈 II 워터 재킷	장치
디메틸설폭사이드(DMSO)	시그마 라이프사이언	D2650-100mL	시약
둘베코의 변형된 독수리 매체	Gibco/써모피셔	11965-092	세포 배양
에탄올	시그마 알드리치	E7023-500mL	시약
형광 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)	시그마	72987-1MG	시험
무포도당 및 페놀 레드 무함유 DMEM	Gibco/써모피셔	A14430-01	세포 배양
인간 인슐린 10 mg/mL	밀리포어시그마	고양이 N 91077C	시약
페니실린/스트렙토마이신(P/S)	Gibco/써모피셔	15140-122	세포 배양
인산염 완충 용액	시그마-알드리치	DA537-500 밀리리터	세포 배양
방사성 면역침전 분석 용해 완충액	산타 크루즈 생명 공학	사우스캐롤라이나-24948	시험
트립신-EDTA (0.05%)	Gibco/써모피셔	제25300-054	세포 배양