동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
참고: 모든 절차는 송풍기를 켜고 조명을 끈 상태에서 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.
1. 재료 준비
참고: 모든 재료는 재료 표에 나열되어 있습니다.
- 표 1에 따라 배지 1, 원심분리 매체 2 및 형광 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose(2-NBDG 또는 FD-glucose)의 저장 및 작업 용액을 Class II 생물 안전 캐비닛에 준비합니다. 후드 아래의 모든 조명을 꺼서 실험 내내 FD-포도당을 빛으로부터 보호하십시오.
- 즉시 사용 가능한 세포 배양 시약을 사용하십시오: 트립신-EDTA, 인산염 완충 식염수(PBS), 무포도당 및 페놀 무함유 페놀 레드-프리 Dulbecco's Modified Eagle Medium(이하, 무포도당 DMEM).
2. 장기의 세포외 FD-포도당 고갈에 대한 생체 외 측정
- 장기 해부 전에 포도당 대사를 자극하는 화합물로 마우스를 다음과 같이 전처리합니다.
- 9주 된 Lepob 수컷 마우스(n = 11)를 사용합니다. 실험 전에 모든 쥐에게 규칙적인 차우 식단을 먹이십시오.
- 복강내(i.p.) 주사를 위해 마우스를 세 그룹으로 무작위로 할당합니다.
- 대조군 Lepob 그룹의 마우스에 0.1mL의 멸균 PBS(n = 4)를 주입합니다.
- 인슐린 Lepob 그룹의 마우스에 체중(BW) 1g당 12IU 인간 인슐린이 포함된 0.1mL의 멸균 PBS를 주입합니다(n= 3).
- AAC2 Lepob 그룹의 마우스에 체중(BW) 1g당 0.1nmol AAC2를 포함하는 0.1mL의 멸균 PBS를 주입합니다(n = 4).
- 15분 후, 마취된 동물의 심장 천자로 생쥐에게 5% 이소플루란을 흡입하고 혈액을 출
혈시킵니다.
- 각 동물의 내장 표피지방 백색 지방 조직(200mg), 간(200mg) 및 뇌 전체를 절개합니다. 조직 취급을 위해 Class II 생물 안전 후드를 사용하십시오.
- 빛이 없는 Class II Biosafety 캐비닛에서 포도당이 없는 DMEM으로 FD-glucose(0.29mM) 작업 용액을 준비합니다.
- 마이크로플레이트 리더를 사용하여 각각 485 및 535 nm의 여기 및 방출 파장에서 FD-glucose working solution(0.29 mM)의 형광을 측정합니다.
- 수확된 조직/장기를 PBS가 포함된 6웰 플레이트에서 1분 동안 배양합니다. 각 조직 또는 장기를 별도의 웰에서 처리합니다.
- 1분 후, PBS를 흡수하기 위해 멸균 종이 타월에 각 조직을 놓습니다. 조직/장기를 4,000μL의 무포도당 DMEM을 함유한 별도의 6-well plate로 옮기고 2분 동안 배양합니다.
- 2분 후 조직을 제거하고 0.29mM FD-포도당 작업 용액(1mL/웰)이 포함된 6웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. FD-glucose working solution의 조직을 포함하는 6-well plate를 37°C(5% CO2 및 95% 습도)에서 배양합니다.
- 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 및 120분 배양 후 각 웰에서 100μL의 FD-포도당 작업 용액을 수집하여 세포외 FD 포도당 고갈의 역학을 분석합니다. 채취 전후에 흔들어 주십시오.
- 100μL의 FD-포도당 작업 용액을 96웰 플레이트로 옮기고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 각각 485nm 및 535nm의 여기 및 방출 파장에서 형광을 측정합니다.
- 각 동물의 각 장기에 대해 형광을 0분 값(100%)으로 정규화합니다(그림 1).
표 1: 배양 배지 및 FD-포도당 용액의 준비.
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| 솔루션/중간 | 구성 요소 |
| 에탄올 : DMSO (1 : 1 / v / v) | 1-1.5 mL 튜브에 에탄올(200 μL) 및 DMSO(200 μL), 세포 배양 등급 에탄올 및 DMSO 사용 |
| 중간 1 | DMEM(89mL), 페니실린/스트렙토마이신(1%)(1mL) 및 송아지 혈청(10%)(10mL)을 멸균 50mL 튜브에 담았습니다 |
| 원심분리 매체 2 | DMEM(89mL), 페니실린/스트렙토마이신(1%)(1mL) 및 소 혈청(10%)(10mL)을 멸균 50mL 튜브에 담았습니다 |
| 보관 FD-포도당 용액 5mg/mL(14.5mM) | FD 포도당 (1 mg) 및 에탄올 : 0.5 mL 튜브에 DMSO (1 : 1 / v / v) (200 μL); -80 °C에서 우선적으로 아르곤 또는 질소 분위기에서 보관하십시오 |
| 작동 FD- 포도당 용액 5 μg / mL (14.5 mM) | 저장 FD 포도당 해결책 5 mg/mL (1 μL), 포도당 자유로운 DMEM (999 μL); 실험 전에 즉시 준비하십시오. |