세포 외 형광 포도당 아날로그 고갈 측정: 생체 외 마우스 장기의 포도당 흡수를 평가하기 위한 대리 측정 기법

초록

출처: Kumar, S. B. et al., 생체 외 세포 및 조직에서 포도당 흡수의 간접 측정으로서의 세포외 포도당 고갈.J. Vis. 특급(2022년)

이 비디오에서는 적출된 쥐 장기에서 세포외 포도당 아날로그 고갈을 측정하는 생체 외 기술을 보여줍니다. 그것은 세포가 흡수하는 형광 표지된 디옥시글루코스(deoxyglucose)를 포함하는 용액에서 마우스 조직을 배양하는 것을 포함합니다. 포도당 아날로그 흡수는 배양된 배지의 형광을 측정하여 간접적으로 결정할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

참고: 모든 절차는 송풍기를 켜고 조명을 끈 상태에서 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.

1. 재료 준비

참고: 모든 재료는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 표 1에 따라 배지 1, 원심분리 매체 2 및 형광 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose(2-NBDG 또는 FD-glucose)의 저장 및 작업 용액을 Class II 생물 안전 캐비닛에 준비합니다. 후드 아래의 모든 조명을 꺼서 실험 내내 FD-포도당을 빛으로부터 보호하십시오.
2. 즉시 사용 가능한 세포 배양 시약을 사용하십시오: 트립신-EDTA, 인산염 완충 식염수(PBS), 무포도당 및 페놀 무함유 페놀 레드-프리 Dulbecco's Modified Eagle Medium(이하, 무포도당 DMEM).

2. 장기의 세포외 FD-포도당 고갈에 대한 생체 외 측정

1. 장기 해부 전에 포도당 대사를 자극하는 화합물로 마우스를 다음과 같이 전처리합니다.
2. 9주 된 Lep^ob 수컷 마우스(n = 11)를 사용합니다. 실험 전에 모든 쥐에게 규칙적인 차우 식단을 먹이십시오.
3. 복강내(i.p.) 주사를 위해 마우스를 세 그룹으로 무작위로 할당합니다.
   1. 대조군 Lep^ob 그룹의 마우스에 0.1mL의 멸균 PBS(n = 4)를 주입합니다.
   2. 인슐린 Lep^ob 그룹의 마우스에 체중(BW) 1g당 12IU 인간 인슐린이 포함된 0.1mL의 멸균 PBS를 주입합니다(n= 3).
   3. AAC2 Lep^ob 그룹의 마우스에 체중(BW) 1g당 0.1nmol AAC2를 포함하는 0.1mL의 멸균 PBS를 주입합니다(n = 4).
4. 15분 후, 마취된 동물의 심장 천자로 생쥐에게 5% 이소플루란을 흡입하고 혈액을 출
혈시킵니다.
5. 각 동물의 내장 표피지방 백색 지방 조직(200mg), 간(200mg) 및 뇌 전체를 절개합니다. 조직 취급을 위해 Class II 생물 안전 후드를 사용하십시오.
6. 빛이 없는 Class II Biosafety 캐비닛에서 포도당이 없는 DMEM으로 FD-glucose(0.29mM) 작업 용액을 준비합니다.
7. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 각각 485 및 535 nm의 여기 및 방출 파장에서 FD-glucose working solution(0.29 mM)의 형광을 측정합니다.
8. 수확된 조직/장기를 PBS가 포함된 6웰 플레이트에서 1분 동안 배양합니다. 각 조직 또는 장기를 별도의 웰에서 처리합니다.
9. 1분 후, PBS를 흡수하기 위해 멸균 종이 타월에 각 조직을 놓습니다. 조직/장기를 4,000μL의 무포도당 DMEM을 함유한 별도의 6-well plate로 옮기고 2분 동안 배양합니다.
10. 2분 후 조직을 제거하고 0.29mM FD-포도당 작업 용액(1mL/웰)이 포함된 6웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. FD-glucose working solution의 조직을 포함하는 6-well plate를 37°C(5% CO₂ 및 95% 습도)에서 배양합니다.
11. 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 및 120분 배양 후 각 웰에서 100μL의 FD-포도당 작업 용액을 수집하여 세포외 FD 포도당 고갈의 역학을 분석합니다. 채취 전후에 흔들어 주십시오.
12. 100μL의 FD-포도당 작업 용액을 96웰 플레이트로 옮기고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 각각 485nm 및 535nm의 여기 및 방출 파장에서 형광을 측정합니다.
13. 각 동물의 각 장기에 대해 형광을 0분 값(100%)으로 정규화합니다(그림 1).

표 1: 배양 배지 및 FD-포도당 용액의 준비.

. . .

솔루션/중간	구성 요소
에탄올 : DMSO (1 : 1 / v / v)	1-1.5 mL 튜브에 에탄올(200 μL) 및 DMSO(200 μL), 세포 배양 등급 에탄올 및 DMSO 사용
중간 1	DMEM(89mL), 페니실린/스트렙토마이신(1%)(1mL) 및 송아지 혈청(10%)(10mL)을 멸균 50mL 튜브에 담았습니다
원심분리 매체 2	DMEM(89mL), 페니실린/스트렙토마이신(1%)(1mL) 및 소 혈청(10%)(10mL)을 멸균 50mL 튜브에 담았습니다
보관 FD-포도당 용액 5mg/mL(14.5mM)	FD 포도당 (1 mg) 및 에탄올 : 0.5 mL 튜브에 DMSO (1 : 1 / v / v) (200 μL); -80 °C에서 우선적으로 아르곤 또는 질소 분위기에서 보관하십시오
작동 FD- 포도당 용액 5 μg / mL (14.5 mM)	저장 FD 포도당 해결책 5 mg/mL (1 μL), 포도당 자유로운 DMEM (999 μL); 실험 전에 즉시 준비하십시오.

결과

그림 1: 생체 외 다양한 장기에서 세포 외 FD-포도당 고갈의 동역학 (A-C) Lep^ob 마우스에 비히클(PBS, n = 4), 인슐린(12 IU/kg BW, n = 3) 및 AAC2(1 nmol/g BW, n = 3)를 주입했습니다. 15분 후, 조직을 해부하고 분리했습니다. (A) 내장 지방, (B) 간 및 (C) 뇌의 외식을 FD-포도당(0.29mM)에서 배양했습니다. 세포외 포도당 고갈의 동역학은 서로 다른 시점에서 배지의 부분 표본으로 측정되었습니다. 데이터(평균 SD)는 배양 0분 시 각 장기의 형광 %로 표시됩니다. 유의성 P <...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96웰 플레이트	송골매	353227	플라스틱 도자기
나6. V-Lepob / J 수컷 마우스	잭슨 연구소	재고 번호 000632	마우스
BioTek Synergy H1 모듈식 멀티모드 마이크로플레이트 리더(Fisher Scientific, 미국)	Fisher Scientific, 미국	Fisher Scientific, 미국	장치
세포 배양기	견적	시리즈 II 워터 재킷	장치
다이어트(마우스/랫트 다이어트, 방사선 조사)	엔비고	테클라드 LM-485	다이어트
이소플루란, 5%	헨리 샤인	재질 보기 NDC 11695-6776-2	아네스테틱
인산염 완충 용액	시그마-알드리치	DA537-500 밀리리터	세포 배양
페니실린/스트렙토마이신(P/S)	Gibco/써모피셔	15140-122	세포 배양
무포도당 및 페놀 레드 무함유 DMEM	Gibco/써모피셔	A14430-01	세포 배양
형광 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-Dglucose)	시그마	72987-1MG	시험
둘베코의 변형된 독수리 매체	Gibco/써모피셔	11965-092	세포 배양
소 세럼	Gibco/써모피셔	제161790-060	세포 배양
에탄올	시그마-알드리치	E7023-500mL	시약

년 (영문) 년 호