체외 SMC 수축 측정: 전기 세포 기질 임피던스 감지를 사용하여 평활근 세포 수축을 평가하는 비침습적 방법

초록

출처: Bogunovic, N. et al., 원발성 환자 특이적 대동맥 평활근 세포의 분리 및 반정량적 실시간 수축 측정 In Vitro. J. Vis. 특급 (2022).

이 동영상은 전기 세포-기질 임피던스 감지(ECIS)를 사용하여 대동맥 평활근 세포(SMC) 수축을 측정하는 방법을 설명합니다. ECIS는 세포의 이동을 측정하며 수축을 측정하는 신뢰할 수 있는 방법입니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 기관, 국가 및 국제 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회에서 검토되었습니다

1. 수축 측정 (예 : SMC)

1. 96w10e ECIS 어레이를 준비합니다(확대된 전극과 전극에 시드된 셀이 있는 어레이의 대표 이미지는 그림 1A 참조).
   참고: 멸균 조직 배양 층류 후드 아래에서 다음 단계를 수행합니다.
   1. 실온에서 30분 동안 웰당 200μL의 10mM L-시스테인으로 멸균 96w10e 어레이를 코팅합니다.
   2. 멸균수로 접시를 두 번 씻으십시오. 뚜껑을 약간 열어 조직 배양 후드에서 플레이트를 밤새 건조시킵니다.
      알림: 플레이트를 L-시스테인으로 코팅하는 것은 플레이트를 처음 사용할 때만 필요합니다.
   3. 다음날 접시와 뚜껑을 30분 동안 UV 살균하고 뚜껑을 위로 돌려 내부를 살균합니다. 플레이트가 멸균되면 플로우 후드 외부에서 플레이트를 열지 마십시오.
2. ECIS 어레이의 세포 시딩
   1. 1% 멸균 젤라틴 용액을 수조에서 30분 동안 예열합니다.
      알림: 용액은 냉장고에 보관되어 응고되어 피펫팅이 어려울 수 있습니다.
   2. 그런 다음 웰당 100μL의 1% 젤라틴 용액으로 웰을 코팅하고 37°C에서 최소 1시간 동안 플레이트를 배양합니다.
   3. 우물에서 젤라틴을 흡입하십시오.
   4. 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하고 200μL의 SMC 배지에서 30,000 cells/well의 시딩 밀도로 SMC를 3회 시딩합니다.
   5. SMC가 있는 플레이트를 세포 배양 인큐베이터의 ECIS 96웰 홀더에 놓습니다. ECIS Applied Biophysics 소프트웨어를 두 번 클릭하여 프로그램을 열고 설정 버튼을 누릅니다.
   6. 모든 전극이 Well Configuration이라고 표시된 왼쪽 하단 패널의 홀더(녹색, 연결되지 않은 경우 빨간색)와 접촉하는지 확인합니다. 전극이 제대로 연결되지 않은 경우 측정을 시작하기 전에 홀더의 플레이트를 조정하십시오.
   7. Array type(어레이 유형)을 클릭하여 동일한 패널에서 플레이트 유형(96-well array)을 선택합니다.
   8. 오른쪽 상단 패널 Data Collection Setup(데이터 수집 설정)에서 단일 주파수를 클릭하고 임피던스 값을 4000Hz로 변경하고 간격을 8s로 변경합니다.
   9. 시작 버튼을 클릭하여 측정을 시작합니다. ECIS 파일을 저장할 수 있는 새 패널이 열릴 때까지 기다립니다.
   10. 세포가 부착되어 48 h.
       동안 단층을 형성하도록 합니다. 알림: 전극에 세포를 부착하고 퍼뜨리면 기준선 저항 값이 생성됩니다(그림 1B).
3. 수축을 유도하기 위한 세포 자극
   1. 10 μg/mL의 칼슘 이오노포단인 ionomycin.
      로 세포를 자극하여 SMC 수축을 유도합니다. 참고: 이오노마이신은 세포외 Ca²⁺의 유입을 유도하여 수축 캐스케이드를 활성화합니다. 비자극 및 자극된 수축 세포의 대표적인 이미지는 그림 2A를 참조하십시오.
   2. 100μL의 디메틸설폭사이드에 1mg의 이오노마이신 분말을 희석하여 10mg/mL의 원액을 만들고 -20°C에서 10μL 분취액을 보관합니다. 사용하기 전에 SMC 배지에서 이오노마이신 용액을 1:10으로 희석하여 세포에 추가할 작업 용액을 준비합니다.
   3. 어레이가 세포 배양 인큐베이터 내부의 어레이 홀더에 있고 전극이 시스템에 부착된 상태에서 세포 자극을 수행합니다.
      1. 세포를 자극하려면 뚜껑을 제거하고 인큐베이터 내부의 멸균 표면에 놓으십시오. 2 μL 및 150 μL로 설정된 두 개의 피펫을 준비합니다.
      2. 자극을 시작하기 전에 소프트웨어에서 Mark를 누르고 댓글을 달아주세요.
         참고: 이렇게 하면 데이터를 분석할 때 자극의 정확한 타이밍을 더 쉽게 찾을 수 있습니다.
      3. 2 μL의 ionomycin 작업 용액을 가능한 한 빨리 각 웰에 피펫팅합니다. 모든 세포가 자극되면 두 번째 피펫을 사용하여 웰에서 배지를 혼합합니다.
         참고: 빠른 효과로 인해 다른 세포주와 조건 간에 팁을 변경할 필요가 없습니다. ionomycin에는 급성 효력이 있기 때문에 자극하고 섞는 동안 빨리 일하십시오. 가득 찬 플레이트를 자극할 때 한 번에 최대 3개의 기둥을 자극합니다. 모든 자극 후에는 인큐베이터 도어 열로 인한 온도와 CO₃₀ 변화로부터 세포가 회복될 때까지 다음 자극까지 최소 2분 동안 기다립니다.
      4. 자극이 완료된 직후 Mark를 다시 눌러 자극이 완료되었다는 설명을 추가합니다.
4. 자극 실험 마무리
   1. ionomycin 자극 후 약 5분 동안 임피던스 값을 기록합니다. Finish를 눌러 녹음을 마칩니다.

결과

그림 1: ECIS 플레이트 설정 및 대동맥 SMC 수축의 그래픽 표현. (a) 왼쪽; 96웰 ECIS 플레이트. 중간; ECIS 플레이트의 한 웰을 확대하여 웰 바닥에 있는 10개의 전극을 보여줍니다. 오른쪽; ECIS 플레이트에 시딩된 SMC의 광학 현미경 이미지; 배율 10x. (B) 대조군 SMC를 3회 시딩한 후 ECIS가 측정한 저항 곡선. 굵은 파란색 선은 삼중의 평균을 나타내고 점선은 삼중의 SD를 나타냅니다. 파종 후 처음 4-5시간 동안 SMC가 전체 표면에 퍼지고 높은 저항(~1000 Ω)이 측정됩니다. 안정적인 SMC 단층이 형성되면 시간이 지남에 따라 저항이 약 500 Ω로 감소합니다. 약어: ECIS = electric cell-sub...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96웰 어레이	응용 생물 물리학	96W10idf 애완 동물	ECIS 설정에서 수축을 측정하는 데 사용되는 어레이
인간 혈관 평활근 세포 기초 배지 (이전 ''Medium 231'')	지브코	M231500	평활근 세포를 배양하는 데 사용되는 배지
디메틸 설폭사이드	시그마-알드리치	472301	ionomycin를 희석하는 데 사용되는 용액
Invitrogen 백작 부인 II	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000	자동 세포 계수기
Streptomyces conglobatus에서 추출한 아이오노마이신 칼슘 염	시그마-알드리치	I0634-1MG	수축 자극에 사용되는 화합물
Z테타	응용 생물 물리학	Z테타	수축 측정에 사용되는 ECIS 기기