Gliding Actin Filament Assay: 고정된 Myosins에 대한 Actin 필라멘트의 전좌를 연구하기 위한 In Vitro Motility Assay

초록

출처: Tripathi, A., et al. 체외 형광 현미경 검사 기반 운동성 분석의 미오신 특이적 적응. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오에서는 액틴-미오신 상호작용을 분석하기 위해 체외 운동성 분석을 수행합니다. 고정된 미오신 분자에 대한 액틴 필라멘트의 활공 운동은 형광 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

프로토콜

1. 글라이딩 액틴 필라멘트 분석

1. 커버슬립 준비
   1. 아밀 아세테이트에 1% 니트로셀룰로오스 용액을 만듭니다.
   2. 조직 배양 접시(150 x 25mm)를 구하고 접시 바닥에 원형 여과지(직경 125mm)를 추가합니다.
   3. 1.5 두께, 22mm 정사각형 커버 슬립 8개를 랙에 넣고 약 2-5mL의 200프루프 에탄올과 2-5mL의 증류수(dH₂O)로 세척합니다. 물로 끝내는 이 세척 단계를 반복합니다. 그런 다음 여과된 공기 라인 또는 N₂-라인을 사용하여 커버슬립을 완전히 건조시킵니다.
   4. 커버슬립 1개를 취하고 슬립의 한쪽 가장자리를 따라 1% 니트로셀룰로오스 용액 10μL를 천천히 피펫팅합니다. 그런 다음 한 번의 부드러운 동작으로 부드러운 면의 200 μL 피펫 팁 측면을 사용하여 커버슬립의 나머지 부분에 문지릅니다. 니트로셀룰로오스 면이 위로 향하게 하여 조직 배양 접시에 이 커버슬립을 놓습니다. 나머지 커버슬립에 대해 반복하고 나머지 시약을 준비하는 동안 건조시키고 코팅 후 24시간 이내에 커버슬립을 사용합니다.
2. 챔버 준비
   1. 광학 렌즈 용지로 현미경 슬라이드를 닦아 큰 이물질을 닦아냅니다. 약 2cm 길이의 양면 테이프 두 개를 자릅니다.
   2. 현미경 슬라이드의 긴 가장자리 중앙을 따라 한 조각을 놓습니다. 테이프의 가장자리가 슬라이드의 가장자리와 정렬되는지 확인합니다. 두 번째 테이프 조각이 평행하고 정렬되도록 두 번째 테이프 조각을 첫 번째 테이프 조각 아래에 약 2mm 아래에 놓습니다. 이렇게 하면 약 10μL의 용액을 담을 수 있는 플로우 챔버가 생성됩니다(그림 1 참조).
   3. 파트 1에서 니트로셀룰로오스 코팅된 커버슬립 중 하나를 예로 들어 보겠습니다. 니트로셀룰로오스로 코팅된 면이 테이프와 직접 접촉하도록 커버슬립을 테이프에 조심스럽게 붙입니다(그림 1 참조). 피펫 팁을 사용하여 슬라이드 테이프 인터페이스를 부드럽게 눌러 커버슬립이 슬라이드에 제대로 부착되었는지 확인합니다. 슬라이드 가장자리에 매달려 있는 여분의 테이프를 면도날로 자릅니다.
3. 액틴 준비
   1. 4°C에서 하룻밤 동안 중합 완충액(50mM KCl, 2mM MgCl₂, 1mM DTT, 25mM MOPS(pH 7.0))에서 구형 액틴(G-actin)을 중합하여 20μM F-actin을 만듭니다.
   2. F-actin을 운동성 완충액(20mM MOPS, 5mM MgCl₂, 0.1mM EGTA, 1mM DTT(pH 7.4))에서 5μM로 희석합니다. 최소 1.2x 몰 초과량의 로다민-팔로이딘이 있는 라벨. 얼음 위에서 최소 2시간 동안 (알루미늄 호일로 덮음) 그대로 두십시오. 최대 1-2개월 동안 사용할 수 있으며 얼음에 보관할 수 있습니다.
4. myosin 5a 글라이딩 액틴 필라멘트 분석 수행
   참고: 이 섹션에서는 myosin 5a(HMM) 글라이딩 분석에 대한 세부 정보를 제공합니다.
   1. 표 1에 설명된 myosin 5a에 대한 용액을 준비하고 얼음 위에 보관하십시오.
   2. 유동 챔버를 통해 10μL의 미오신 5a(50-100nM)를 흐르게 하고 1분 동안 기다립니다.
   3. 1mM DTT("저염" 완충액)를 사용하여 50mM MB에서 1mg/mL BSA 10μL로 흐름. 이 세척을 두 번 더 반복하고 세 번째 세척 후 1분 동안 기다립니다. 티슈 페이퍼 또는 여과지의 모서리를 사용하여 용지 모서리를 플로우 챔버 출구에 부드럽게 놓아 채널을 통해 용액을 wickwick합니다.
   4. 10 μL의 50 mM MB와 1 mM DTT로 세척합니다. 이 세척을 두 번 더 반복합니다.
   5. 10 μL의 블랙 액틴 용액(5 μM F-액틴, 1 μM 칼모듈린 및 1 mM DTT로 50 mM MB에 1 mM ATP)을 주입하여 "데드 헤드"를 제거합니다.
      1. 용액을 챔버에 도입하기 전에 1mL 주사기와 27G 바늘로 용액을 피펫팅하여 액틴 필라멘트를 전단합니다. 이 단계를 두 번 더 반복하고 세 번째 반복 후 1분 동안 기다립니다. 약 20회의 피펫팅 이벤트로 충분합니다.
      2. "데드 헤드(dead head)" 스핀을 수행하려면 500mM의 염 농도에서 1mM ATP 및 1mM MgCl₂가 있는 상태에서 미오신 농도에 화학량론적 양의 F-actin을 추가합니다. 그런 다음 480,000 x g에서 4°C에서 15분 동안 초원심분리기를 합니다. 죽은 미오신 (myosin)은 펠릿에 있을 것입니다.
   6. 1mM DTT 및 1mM ATP를 사용하여 50μL의 50mM MB를 유동시켜 유리 액틴 필라멘트의 챔버를 고갈시킵니다.
   7. 10 μL의 50 mM MB와 1 mM DTT로 세척합니다. 이 세척을 두 번 더 반복하여 챔버의 ATP를 고갈시킵니다.
   8. 50mM MB에 1mM DTT를 포함하는 20nM 로다민 액틴(Rh-Actin) 용액 10μL를 넣고 커버슬립 표면에 부착된 미오신 5a에 액틴 필라멘트가 엄격하게 결합할 수 있도록 1분 동안 기다립니다.
   9. 10 μL의 50 mM MB와 1 mM DTT로 세척하여 표면에 결합되지 않은 Rh-Actin 필라멘트를 씻어냅니다. 이 세척을 두 번 더 반복합니다.
   10. 30μL의 최종 버퍼로 유동합니다.
   11. 561nm의 여기 파장을 사용하여 형광 현미경에 이미지를 기록하여 Rh-Actin을 시각화합니다. 적절한 노출 시간은 1.4mW 레이저 출력에서 200ms이며 총 획득 시간은 0.5-1분
       입니다. 알림: 획득 속도가 움직이는 필라멘트의 속도에 적절하게 조정되었는지 확인하십시오. 추적 프로그램에 사용하기 위해 데이터를 수집하기 전에 고려해야 할 중요한 사항은 획득 프레임 속도입니다. 프레임 간의 하위 픽셀 이동은 속도를 과대 평가하는 결과를 초래하며 정확한 값을 얻으려면 수백 나노미터의 움직임이 필요합니다. 최적의 획득 속도는 프레임 간 최소 1픽셀 거리에서 액틴 글라이딩을 특징으로 합니다. 여기에서 이미징에 사용된 TIRF 현미경의 경우 이 임계값은 130nm로 변환됩니다. 따라서 1μm/s로 이동할 것으로 예상되는 미오신 신호는 200nm 이동을 달성하기 위해 5 frames/s(0.2s 간격)의 속도로 이미징해야 하는 반면, 10 nm/s 이동할 것으로 예상되는 myosin은 0.05 frames/s (20s 간격)가 필요합니다. 따라서 필요한 경우 이 단계에서 데이터를 다운샘플링할 수 있습니다.

표 1: 글라이딩 분석에 사용되는 버퍼

버퍼 이름	조성물(M5a)	조성 (NM2b)	사용 단계(M5a/NM2b)	코멘트
4X 운동성 버퍼(4X MB)	80mM 걸레, pH 7.2	80mM 걸레, pH 7.2		진공 필터 및 4°C에 보관
	20 mM 마그네슘Cl2	20 mM 마그네슘Cl2
	0.4mM 에그타	0.4mM 에그타
	산도 7.4	산도 7.4
50mM 염 운동성 버퍼(50mM MB)	25% V/V 4X MB	25% V/V 4X MB		진공 필터 및 4°C에 보관
	50 mM KCl	50mM 염화나트륨
	dH2O로 볼륨을 높이십시오.	dH2O로 볼륨을 높이십시오.
500mM 염 운동성 버퍼(500mM MB)	N/A	25% V/V 4X MB		진공 필터 및 4°C에 보관
	500mM 나트륨
	dH2O로 볼륨을 높이십시오.
미오신	0.05-0.1 μM 미오신	0.2μM 미오신	4.2	얼음 위에 두십시오.
	1mM DTT	1mM DTT
	50mM MB로 희석	500mM MB로 희석
1 mg/mL 소 혈청 알부민(BSA)	1 mg/mL BSA	1 mg/mL BSA	4.3	얼음 위에 두십시오.
	50mM MB로 희석	500mM MB로 희석
	1mM DTT	1mM DTT
5μM 50mM MB의 라벨링되지 않은 F-액틴(블랙 액틴)	5μM 비표지 F-액틴	5μM 비표지 F-액틴	4.5	얼음 위를 유지하세요. 액틴을 위아래로 5-10회 피펫팅하거나 주사기를 사용하여 전단합니다.
	1μM 칼모듈린(CaM)	1mM ATP
	1mM ATP	0.2 mM 염화칼슘2
	50mM MB로 희석	1μM 크롬
		1–10nM 미오신 경쇄 키나아제(MLCK)
		50mM MB로 희석
MB	1mM DTT	1mM DTT	4.6	얼음 위에 두십시오.
1mM ATP	1mM ATP
50mM MB로 희석	50mM MB로 희석
MB(DTT 포함)	1mM DTT	1mM DTT	4.4, 4.7, 4.9	얼음 위에 두십시오.
	50mM MB로 희석	50mM MB로 희석
20 nM 로다민-팔로이딘 F-액틴(Rh-액틴)	20 nM 로다민-팔로이딘 F-액틴	20 nM 로다민-팔로이딘 F-액틴	4.8	얼음 위에 두십시오. 소용돌이치지 마십시오.
	1mM DTT	1mM DTT
	50mM MB로 희석	50mM MB로 희석
최종 버퍼	50 mM KCl	0.7% 메틸셀룰로오스(선택 사항)	4.10	실험을 수행하기 직전에 포도당, 포도당 산화효소 및 카탈라아제를 첨가하십시오. 얼음 위에 보관하십시오.
	20mM 걸레, pH 7.2	50mM 염화나트륨
	5mM 마그네슘Cl2	20mM 걸레, pH 7.2
	0.1 mM 에그타	5mM 마그네슘Cl2
	1mM ATP	0.1 mM 에그타
	50 mM DTT	1mM ATP
	1μM 칼모듈린	50 mM DTT
	2.5mg/mL 포도당	1–10nM MLCK
	100 μg/mL 포도당 산화효소	0.2 mM 염화칼슘2
	40 μg/mL 카탈라아제	1μM 칼모듈린
		2.5mg/mL 포도당
		100 μg/mL 포도당 산화효소
		40 μg/mL 카탈라아제

결과

그림 1: 기능화된 플로우 셀 챔버의 준비. (A) 청소된 현미경 슬라이드, 약 2cm로 자른 양면 테이프 2개, 기능적인 커버 슬립으로 시작합니다. (B) 현미경 슬라이드의 중앙에 테이프를 추가합니다. (C) 코팅(즉, 니트로셀룰로오스)이 아래를 향하도록 하여 커버슬립을 테이프에 부착하고 플라스틱 피펫 팁을 사용하여 테이프와 겹치는 영역을 부드럽게 눌러 커버슬립이 챔버에 부착되었는지 확인합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아밀 아세테이트	래드 리서치 인더스트리	10825
ATP	밀리포어 시그마	A7699
소 세럼 알부민	밀리포어 시그마	5470
칼모듈린		PMID: 2985564
카탈라아제	밀리포어 시그마	C40
원형 여과지 - 글라이딩 분석	밀리포어 시그마	WHA1001125
커버슬립 랙	밀리포어 시그마	Z688568-1개
Coverslips: 글라이딩 연기 필라멘트 분석	VWR 국제공항	제48366-227
DL-디티오트레이톨	밀리포어 시그마	D0632
양면 테이프	오피스 디포	909955
에그타	밀리포어 시그마	E4378
에탄올	피셔 사이언티픽	A4094 (영어
G-액틴		PMID: 4254541	G-actin 스톡은 액체 N2에 200μM로 보관할 수 있습니다.
포도당	밀리포어 시그마	G8270
포도당 산화효소	밀리포어 시그마	G2133 (영어
케이클	피셔 사이언티픽	P217-500
대형 오리피스 피펫 팁	피셔 사이언티픽	02-707-134
메틸셀룰로오스	밀리포어 시그마	M0512
현미경 슬라이드	피셔 사이언티픽	제12-553-10
걸레	피셔 사이언티픽	BP308-100
니트로셀룰로오스	래드 리서치 인더스트리	10800
면도날	오피스 디포	397492
로다민-팔로이딘	써모피셔 사이언티픽	R415	스톡은 100% 메탄올에서 최종 농도 200μM까지 희석할 수 있습니다.
조직 배양 접시 - 글라이딩 분석	코 닝	353025	각 조직 배양 접시에는 약 9개의 커버슬립이 담겨 있습니다.
매끄러운 면의 200 μL 피펫 팁	토마스 사이언티픽	1158U38
설비
원심 분리기	써모피셔 사이언티픽	75006590
현미경	니콘	모델: 100x TIRF 대물렌즈를 가진 H-TIRF 시스템을 사용한 Eclipse Ti (N.A. 1.49)
현미경 카메라	안도르	모델: iXon DU888 EMCCD 카메라(1024 x 1024 센서 형식)
현미경 환경 통제 상자	도카이 히트	맞춤형 써모박스
현미경 레이저 장치	니콘	LU-n4 405nm, 488nm, 561nm 및 640nm용 고체 레이저가 있는 4개의 레이저 장치
Optima Max-XP 탁상용 초원심분리기	벡크만 쿨터	393315

년 시리즈 의 시리즈 호 ) ) (영문) 호 년 시리즈