Inverted Motility Assay: An In Vitro technique to visualize myosin movement on immobilized actin filaments(반전 운동성 분석: 고정된 액틴 필라멘트에서 미오신 이동을 시각화하는 In vitro 기술)

초록

출처: Tripathi, A., et al. 체외 형광 현미경 검사 기반 운동성 분석의 미오신 특이적 적응. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오에서는 액틴-미오신 상호작용을 분석하기 위해 체외 운동성 분석을 수행합니다. 고정된 미오신 분자에 대한 액틴 필라멘트의 활공 운동은 형광 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

프로토콜

1. 단백질 정제

1. 세포 용해 및 단백질 추출
   1. 표 1을 기반으로 1.5x 추출 버퍼를 준비합니다. 여과하여 4 °C에서 보관하십시오.
   2. 얼음 위에서 세포 알갱이를 해동하기 시작합니다. 펠릿이 해동되는 동안 추출 버퍼 100mL에 1.2mM 디티오트레이톨(DTT), 5μg/mL 류펩틴, 0.5μM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF) 및 프로테아제 억제제 정제 2정을 추가합니다. 얼음 위에 보관하십시오.
   3. 펠렛이 해동되면 세포 배양 10mL당 보충된 추출 버퍼(Extraction Buffer) 1mL를 추가합니다. 예를 들어, 세포 펠릿이 500mL의 세포 배양으로 형성된 경우 50mL의 보충된 추출 버퍼를 펠릿에 추가합니다.
   4. 세포 펠릿을 얼음 위에 두면서 초음파 처리하십시오. 각 펠릿에 대해 다음 조건을 사용하십시오: 5초 켜기, 5초 끄기, 5분 지속, 전력 4-5.
   5. 균질화된 모든 용해물을 비커에 모으고 ATP(0.1M 원액, pH 7.0)를 첨가하여 ATP의 최종 농도가 1mM이 되도록 합니다. 차가운 방에서 15분 동안 저어줍니다. ATP는 액틴에서 활성 미오신 물질을 분리하여 다음 원심분리 단계에서 분리할 수 ....

결과

그림 1: 기능화된 플로우 셀 챔버의 준비.(A) 청소된 현미경 슬라이드, 약 2cm로 자른 양면 테이프 2개, 기능적인 커버 슬립으로 시작합니다. (B) 현미경 슬라이드의 중앙에 테이프를 추가합니다. (C) 코팅이 아래를 향하도록 커버슬립을 테이프에 부착하고 플라스틱 피펫 팁을 사용하여 테이프와 겹치는 부분을 부드럽게 눌러 커버슬립이 챔버에 부착되었는지 확인합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2 M MgCl2 용액	폭스바겐	10128-298
5M NaCl 용액	KD메디컬	RGE-3270
아세트산	써모피셔 사이언티픽	984303
Anti-FLAG M2 어피니티 젤	밀리포어 시그마	A2220	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP	밀리포어 시그마	A7699
비오틴화 G-액틴	세포골격, Inc.	AB07
소 세럼 알부민	밀리포어 시그마	5470
bPEG-실란	레이산바이오(주)	비오틴-PEG-SIL-3400-1g
Bradford 시약 농축액	바이오 라드	5000006
칼모듈린		PMID: 2985564
카탈라아제	밀리포어 시그마	C40
SF-900 II SFM의 세포주(Sf9)	써모피셔 사이언티픽	11496015	http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
원형 여과지 - 반전 분석	밀리포어 시그마	WHA1001090
완전한 EDTA-Free 프로테아제 억제제 정제	밀리포어 시그마	5056489001	이것은 4 °C에서 보관해야 합니다. 정제는 직접 사용하거나 1 정제를 2mL의 증류수에 용해시켜 25x 스톡 용액으로 재구성할 수 있습니다. 생성된 용액은 4°C에서 1-2주 동안 보관하거나 -20°C에서 최소 12주 동안 보관할 수 있습니다.
농축 튜브(100,000MWCO)	EMD 밀리포어 코퍼레이션	UFC910024	MWCO가 정제되는 단백질의 총 분자량보다 작은 한 튜브의 MWCO가 반드시 "모든 사람에게 맞는 단일 크기"는 아닙니다. M5a는 30,000MWCO 튜브로 농축되었습니다.
쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 염료	써모피셔 사이언티픽	20278
커버슬립 랙	밀리포어 시그마	Z688568-1개
커버슬립: 반전된 운동성 분석	아제르 사이언티픽	ES0107052
투석 튜브(3500 Dalton MCWO)	피셔 사이언티픽	08-670-5ᄀ	투석관의 직경은 다양할 수 있지만 MWCO는 동일해야 합니다. 튜브는 4 °C에서 20 % 알코올 용액에 보관할 수 있습니다.
DL-디티오트레이톨	밀리포어 시그마	D0632
양면 테이프	오피스 디포	909955
DYKDDDDK 펩타이드	진스크립트	RP10586	이는 0.1M NaCl, 0.1mM EGTA, 3mM NaN3 및 10mM MOPS(pH 7.2)를 포함하는 완충액에 최종 농도 50mg/mL까지 용해될 수 있습니다. 이는 -20°C에서 300μL 분취액으로 저장할 수 있습니다.
에그타	밀리포어 시그마	E4378
용리 컬럼	바이오 라드	761-1550	이것들은 재사용할 수 있습니다. 청소하려면 2-3 컬럼 부피의 PBS와 증류수로 컬럼을 헹굽니다. 사용하기 전에 컬럼을 4°C로 냉각하십시오.
에탄올	피셔 사이언티픽	A4094 (영어
포도당	밀리포어 시그마	G8270
포도당 산화효소	밀리포어 시그마	G2133 (영어
글리신 완충 용액, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L	산타 크루즈 생명 공학	사우스캐롤라이나-295018
염산(HCl)	밀리포어 시그마	320331
케이클	피셔 사이언티픽	P217-500
대형 오리피스 피펫 팁	피셔 사이언티픽	02-707-134
루펩틴 프로테아제 억제제	써모피셔 사이언티픽	78435
Mark12 얼룩지지 않은 표준 사다리	써모피셔 사이언티픽	LC5677
메탄올	밀리포어 시그마	MX0482
현미경 슬라이드	피셔 사이언티픽	제12-553-10
걸레	피셔 사이언티픽	BP308-100
mPEG-실란	레이산바이오(주)	MPEG-SIL-2000-1G
NaN3	밀리포어 시그마	S8032 (영어
뉴트르아비딘	써모피셔 사이언티픽	31050
NuPAGE 4 - 12% Bis-Tris 미니 단백질 젤, 15웰	써모피셔 사이언티픽	NP0323PK2
NuPAGE LDS 샘플 버퍼(4X)	써모피셔 사이언티픽	NP0007
인산염 완충 식염수, pH 7.4	써모피셔 사이언티픽	10010023
증권 시세	밀리포어 시그마	78830	PMSF는 이소프로판올에서 0.1M 원액으로 만들고 4°C에서 보관할 수 있습니다. 이소프로판올을 첨가하면 결정 침전이 발생하며, 이는 실온에서 교반하여 용해될 수 있습니다. 사용 직전에 PMSF를 빠르게 교반하는 용액에 최종 농도 0.1mM까지 적가할 수 있습니다.
면도날	오피스 디포	397492
로다민-팔로이딘	써모피셔 사이언티픽	R415	스톡은 100% 메탄올에서 최종 농도 200μM까지 희석할 수 있습니다.
SF9 미디어	써모피셔 사이언티픽	제12658-027	이것은 4°C에서 보관해야 합니다. 유통 기한은 제조일로부터 18개월입니다.
조직 배양 접시 - 반전 분석	코 닝	353003	각 조직 배양 접시에는 약 4개의 커버슬립을 담을 수 있습니다.
매끄러운 면의 200 μL 피펫 팁	토마스 사이언티픽	1158U38
설비
원심 분리기	써모피셔 사이언티픽	75006590
현미경	니콘	모델: 100x TIRF 대물렌즈를 가진 H-TIRF 시스템을 사용한 Eclipse Ti (N.A. 1.49)
현미경 카메라	안도르	모델: iXon DU888 EMCCD 카메라(1024 x 1024 센서 형식)
현미경 환경 통제 상자	도카이 히트	맞춤형 써모박스
현미경 레이저 장치	니콘	405nm, 488nm, 561nm 및 640nm용 솔리드 스테이트 레이저가 있는 LU-n4 4개의 레이저 장치
미드 벤치 원심분리기	써모피셔 사이언티픽	모델: CR3i
Misonix 초음파 처리기	미소닉스	XL2020
Optima Max-XP 탁상용 초원심분리기	벡크만 쿨터	393315
플라즈마 클리너	Diener electronic GmbH + Co. KG	시스템 유형: Zepto
초음파 발생기 프로브(3.2mm)	큐소니카	4418
표준 인큐베이터	바인더	모델: 56
Waverly 튜브 믹서	웨이벌리	TR6E

년 시리즈 시리즈 의 시리즈 년 년 ) ) (영문) 호 ) 표시기 호 시리즈 시리즈 년