인간화 매개체 효소 방출 분석법: 체외에서 호염질 탈과립 반응을 모니터링하여 테스트 항원의 알레르기 가능성을 스크리닝하는 면역화학적 방법

초록

출처: Wenger, M. et al. Humanized Mediator Release Assay는 알레르겐 효능에 대한 판독 값으로 분석됩니다. J. Vis. 특급 (2021년)

이 비디오에서는 호염질 탈과립화를 유도하기 위해 항원의 알레르기 가능성을 평가하는 시험관 내 방법에 대해 설명합니다. β-hexosamindase는 화학적 매개체 방출의 지표로 사용되며 β-hexosamiminase의 효소 활성은 형광 기질을 사용하여 측정합니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 기관, 국가 및 국제 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. huRBL 세포의 수동적 감작

1. 사전 배양된 Ag8/혈청 현탁액을 250 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
2. 원심분리된 Ag8/혈청 현탁액 50μL를 Ag8 세포 펠릿을 방해하지 않고 huRBL 세포가 포함된 각 웰로 이동합니다.
   1. 무항원 대조군(no antigen control)을 포함하는데, 이는 민감하지만 자극되지 않은 세포(항원을 추가하지 않음)로, 바닥 신호 고원/배경에 대한 표시 역할을 합니다. 백그라운드 및 최대 용해 제어 웰은 혈청으로 감작할 필요가 없습니다. 대신 50μL의 huRBL 배지를 추가하여 웰을 제어합니다.
3. 뚜껑으로 플레이트를 덮고 37 ° C 및 5 % -7 % CO₂에서 밤새 배양합니다.

2. 항원 자극 탈과립 및 매개체 방출

1. 1x Tyrode의 완충액(9.5g/L Tyrode's salts, 0.1% 소 혈청 알부민(BSA), 0.5g/L 탄산수소나트륨(NaHCO₃)_dH2O)에 항원 희석액을 미리 준비합니다. 웰당 최종적으로 100μL가 필요합니다.
   메모: 자연적으로 정제된 것이든 재조합으로 생산된 모든 알레르기 항원이 1x Tyrode의 완충액에서 안정적일 수 있는 것은 아닙니다. 따라서 분석 절차 전에 1x Tyrode의 버퍼에서 안정성 테스트를 수행하십시오. 또는 1x Tyrode의 완충액을 중수소산화물(D₂O)로 희석하여 분석의 신호 대 잡음비를 높입니다.
2. 10 또는 1 μg/mL의 단백질로 시작하는 반응 튜브에서 1:10 희석 시리즈의 관심 항원을 8회 희석합니다.
   알림: 항상 사전에 희석 시리즈를 테스트하십시오. 또는 1:10 희석 시리즈(예: 1:5, 1:20 또는 1:30)를 조정하여 전체 방출 곡선을 다룹니다. 또한 시작 농도는 실험 설정에 따라 달라질 수 있습니다.
3. 96웰 플레이트에 도금된 huRBL 세포를 세척하려면 먼저 플레이트를 조심스럽게 흡인하고 뒤집은 다음 흡수지에 두드려 혈청 함유 세포 배지를 제거합니다.
4. 웰당 200μL의 1x Tyrodes 버퍼로 셀을 세척합니다. 모든 우물을 비슷하게 취급하십시오.
   메모: 세포를 방해하지 않도록 세척 용액을 세포에 천천히 첨가하십시오.
5. 약 30초 동안 그대로 두고 세탁 단계를 총 3회 반복합니다.
6. 마지막으로 세척 용액을 추가한 후 항원 희석액을 계속 추가할 준비가 될 때까지 용액을 우물에 그대로 두십시오.
   메모: 세포를 공기에 너무 오래 노출시키지 마십시오.
7. 100μL의 항원 용액을 사전 감작된 huRBL 세포를 포함하는 각 웰로 전달합니다.
   참고: 여러 다른 파라미터를 분석하는 경우, 희석 시리즈의 개별 샘플을 추가적인 비결합 96웰 플레이트(huRBL 플레이트와 동일한 레이아웃 사용)로 옮기고, 나중에 멀티채널 피펫을 사용하여 huRBL 세포 플레이트에서 직접 옮깁니다. 이렇게 하면 세포가 공기에 너무 오래 노출되는 것을 방지할 수 있으며, 이로 인해 분석 성능이 저하될 수 있습니다(신호 저하/없음).
8. 제어 웰(최대 용해 및 무민감성 배경 세포)을 100μL의 1x Tyrode 완충액으로 덮습니다. 항원으로 이러한 제어 웰을 자극하지 마십시오.
   1. 또한 100μL의 1x Tyrode 완충액을 희석 시리즈의 감작 무항원 웰에 첨가하며, 이는 데이터 분석 중에 감작된 세포의 항원 독립적 자발적 방출을 고려하는 데 필요합니다.
9. huRBL 세포를 37°C 및 5%-7% CO₂에서 1시간 동안 배양합니다.

3. β-hexosaminidase 활성의 형광 측정

1. 최대 용해 제어의 웰을 웰당 10% Triton X-100 10μL로 처리하고 세포를 완전히 용해하고 β-hexosaminidase의 100% 방출을 얻기 위해 적절하게 혼합합니다.
2. 50μL의 기질 용액을 새로운 비결합 96웰 플레이트에 추가합니다. 하나의 96웰 플레이트용 기질 용액: 0.1M 구연산 분석 완충액 5mL, pH 4.5; 및 80 μL의 10 mM 4-메틸룸벨리페릴 N-아세틸-β-D-글루코사마이드.
3. 모든 웰의 세포 상등액 50μL를 기질 용액이 포함된 새 플레이트로 옮깁니다.
   참고: huRBL 세포를 방해하지 않도록 huRBL 플레이트에서 상층액을 조심스럽게 피펫팅합니다.
4. 기질 용액과 세포 상등액으로 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 배양하여 형광 기질이 전환될 수 있도록 합니다.
   메모: 세포 생존도 분석을 위해 huRBL 플레이트를 보관하십시오.
5. 웰당 100μL의 정지 용액(15g/L 글리신, dH_2O에 용해된 11.7g/L NaCl, pH 10.7)을 추가합니다.
6. 플레이트 리더를 사용하여 360nm 여기 및 465nm 방출에서 형광을 측정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
4-메틸룸벨리페릴 N-아세틸-β-D-글루코사미나이드	시그마	M2133
huRBL 세포용 96웰 플레이트(Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Deltatreated, flat-bottom microplate)	써모피셔 사이언티픽	167008
기질 용액 및 세포 상층액용 96웰 플레이트(Greiner BioOne 비처리 96웰 마이크로플레이트)	피셔 사이언티픽	655101
소 혈청 알부민(BSA)	시그마	10735078001
구연산	애플리켐	131018
글리신	애플리켐	A3707 (영어
염화나트륨 (NaCl)	애플리켐	A2942 (영어
탄산수소나트륨(NaHCO3)	애플리켐	131638
트리톤 X-100	시그마	엑스100
티로드의 소금	시그마	T2145

) )