ATP 기반 루시페라제 생존력 분석: 종양 오가노이드에 대한 시험제의 성장 억제 가능성을 평가하기 위한 동질적인 방법

초록

출처: Higa, A. et al. 환자 유래 종양 오가노이드를 사용한 고처리량 체외 분석. J. Vis. 특급 (2021년)

이 비디오에서는 세포 내 ATP 수준을 세포 대사 활동의 마커로 사용하는 테스트 에이전트로 치료할 때 환자 유래 오가노이드에서 세포 생존력을 평가하기 위한 신속한 단일 추가 분석을 시연합니다. 세포 내 ATP 수준은 루시퍼라제/루시페린 반응을 사용하여 측정되며, 여기서 방출된 빛의 강도는 세포 생존력을 나타내고 차례로 테스트 에이전트의 성장 억제 효능을 나타냅니다.

프로토콜

1. 성장 억제 고처리량 스크리닝(HTS)

참고: 환자 유래 종양 오가노이드(PDO)에 대한 항암제의 성장 억제 활성은 그림 1과 같이 세포 내 ATP 함량을 측정하여 평가합니다. 이 단계는 시판되는 세포 생존도 분석 키트를 사용하여 수행됩니다(재료 표 참조).

1. 0일차에 분석에 적절한 수의 세포 클러스터를 사용할 수 있을 때까지 플라스크에서 PDO(예: RLUN007)를 배양합니다. 파종하기 하루 전에 PDO 현탁액을 75cm² 플라스크에서 15mL 튜브로 옮기고 200 x g에서 2분 동안 원심분리하여 PDO 펠릿 부피를 측정합니다. 그런 다음 PDO 펠릿을 15mL의 새로운 배지에 재현탁시키고 75cm² 플라스크로 다시 옮깁니다. 37°C에서 5% CO₂.
   로 세포를 배양합니다. 메모: 필요한 PDO 펠릿 부피는 각 PDO의 희석 속도와 분석에 사용되는 384웰 플레이트의 수에 따라 다릅니다. 예를 RLUN007, 10개의 384웰 플레이트에 파종하기 위해서는 200μL의 세포 펠릿 부피가 필요합니다.
2. 1일차(배지 교체 후 24시간)에 70μm 메쉬 필터가 포함된 필터 홀더로 세포 단편화 및 분산 장비(재료 표 참조)를 사용하여 PDO를 다집니다. 그런 다음 PDO 현탁액 15mL를 10배 희석합니다. 세포 현탁액 디스펜서(재료 표 참조)를 사용하여 PDO 현탁액 40μL를 384웰 초저 부착 스페로이드(둥근 바닥) 마이크로플레이트(재료 표 참조)에 시딩합니다.
   메모: 세포 클러스터를 다지려면 시판되는 세포 단편화 및 분산 장비를 사용하는 것이 좋습니다(재료 표 참조).
3. 파종(2일차) 후 24시간에 액체 처리기를 사용하여 20μM에서 1.0nM(10회 연속 희석)의 최종 농도 범위에서 0.04μL의 시험제 용액으로 PDO를 처리합니다(재료 표 참조).
4. 8일째(시험 물질 처리 후 144시간)에 세포 내 ATP 측정 시약을 시험 웰에 추가합니다. 믹서를 사용하여 플레이트를 혼합하고 25°C에서 10분 동안 배양합니다.플레이트 리더를 사용하여 세포 내 ATP 함량을 발광으로 측정합니다(재료 표 참조).
5. 세포 생존율을 계산하려면 테스트 웰의 ATP 수량을 차량을 포함하는 제어 웰의 ATP 수량으로 나누고 배경을 뺍니다. 6일 동안의 성장률을 계산하려면 파종 후 24시간 후에 차량 제어 우물의 ATP 양을 차량 제어 우물의 ATP 양으로 나눕니다.
6. 생물학적 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 용량-반응 곡선에서 50% 억제 농도(IC₅₀) 및 곡선 아래 면적(AUC) 값을 계산합니다(재료 표 참조). Z 계수는 1(무한 분리)에서 <0 사이의 무차원 매개변수로, Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-|로 정의되며, 여기서 σc+, σc-, μc+ 및 μc-는 높음(c+) 및 낮음(c−) 제어의 표준 편차(σ) 및 평균(μ)입니다. 각각.

결과

그림 1: 384웰 마이크로플레이트를 사용하여 고처리량 분석 시스템을 만드는 데 사용되는 프로토콜 요약.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
384웰 초저 부착 스페로이드 마이크로플레이트	코 닝	4516	HTS용 플레이트
암세포 확장 배지 플러스	후지필름 Wako 순수 화학	TEL.032-25745	F-PDO용 매체
셀펫 FT	제이텍	-	세포 단편화 및 분산 장비
CellTiter-Glo 3D 세포 생존도 분석	프로메가	G9683	세포 생존율 발광 분석법, 세포 내 ATP 측정 시약
에코 555	랩사이트	-	액체 처리기
엔스파이어	퍼킨엘머	-	플레이트 리더
Morphit 소프트웨어, 버전 6.0	엣지 소프트웨어 컨설팅		생물학 데이터 분석 소프트웨어
멀티드롭 콤비	써모피셔 사이언티픽	5840300	셀 서스펜션 디스펜서
RLUN007	후지필름, Wako Pure Chemical 또는 Summit Pharmaceuticals International		폐 종양 유래 F-PDO
초저 부착 75cm² 플라스크	코 닝	3814	PDO를 위한 배양 플라스크