리간드 분석의 차등 방사형 모세관 작용: 박테리아 뉴클레오티드 2차 메신저 결합 세포 내 단백질을 식별하기 위한 고처리량 기술

초록

출처: Schicketanz, M. L., et al. 리간드 분석의 차등 방사상 모세관 작용으로 작은 리간드의 결합 단백질 식별(DRaCALA). J. Vis. 특급 (2021)

이 동영상은 세포 내 뉴클레오티드 2차 메신저 결합 단백질의 체계적인 고처리량 스크리닝 기술인 리간드 분석의 차등 방사형 모세관 작용을 보여줍니다. 이 기술은 세포 용해물에서 과발현된 표적 단백질에 메신저를 직접 결합할 수 있게 하여 단백질 정제의 필요성을 우회

할 수 있습니다.

프로토콜

1. 전체 세포 용해물의 준비

1. E. coli K-12 ASKA ORFeome collection 균주를 96-well deep well plate에 25μg/mL chloramphenicol을 함유한 1.5mL Lysogeny broth(LB)에 접종합니다. 160rpm에서 흔들면서 30°C에서 18시간 동안 밤새(O/N) 성장합니다. 다음 날, O/N 배양액에 이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)(최종 0.5mM)를 첨가하여 30°C에서 6시간 동안 단백질 발현을 유도합니다.
2. 펠릿 셀을 500 x g에서 10분 동안 사용합니다.사용할 때까지 펠릿을 -80°C에서 동결합니다. 세포를 용해하기 위해 150μL의 용해 완충액 L1(40mM Tris pH 7.5, 100mM NaCl, 10mM MgCl₂, 2mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF), 40μg/mL DNase 1 및 0.5mg/mL 라이소자임)을 추가하여 펠릿을 재현탁합니다.
3. -80°C에서 30분 동안 세포를 동결한 다음 37°C에서 20분 동안 해동합니다. 이 주기를 세 번 반복하여 세포를 용해합니다. 사용하기 전에 용해물을 -80 °C에서 보관하십시오.

2. Rel_seq 및 GppA의 정제

참고: 재조합 단백질인 Streptococcus equisimilis의 Rel_seq와 E. coli K-12의 GppA는 각각 방사성 표지된 pppGpp 및 ppGpp를 합성하는 데 사용됩니다.

1. 각 단백질을 과발현하는 세포를 성장시키고 수집합니다.
   1. LB 육물에서 E. coli BL21 DE3 균주를 지수 단계(광학 밀도(OD) ~0.3-0.4)까지 성장시키고 6000 x g에서 5분 동안 1mL의 배양액을 회전시킵니다. 상등액을 디캔팅하고 100μL의 얼음처럼 차가운 TSB 육수(0.1g/mL PEG3350, 0.05mL/mL 디메틸설폭사이드가 보충된 LB 육물, 20 mM MgCl₂ 참조).
   2. 히스티딘 태그가 붙은 relseq 및 gppA가 각각 100ng인 플라스미드를 TSB의 위 세포 현탁액과 혼합하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 42°C에서 40초 동안 세포를 열 충격합니다. 혼합물을 얼음에 2분 동안 놓고 실온에서 LB 육수 1mL를 첨가하여 160rpm에서 교반하면서 37°C에서 1시간 동안 세포가 회복되도록 합니다.
   3. 회복된 세포를 해당 항생제(Rel_seq:100 μg/mL ampicillin; GppA: 30 μg/mL 카나마이신). 다음 날, 37 ° C에서 두 균주의 O / N 사전 배양을 시작하기 위해 LB 국물에 콜로니를 접종합니다.
   4. 18시간 후, 500mL의 LB 배지에 10mL의 O/N 배양액과 해당 항생제를 접종합니다. 37°C에서 160rpm으로 흔들어 배양물을 성장시킵니다. OD_600nm가 0.5-0.7에 도달하면 0.5mM IPTG를 첨가하고 160rpm에서 진탕하면서 30°C에서 3시간 동안 성장하여 단백질 발현을 유도합니다.
   5. 4°C에서 10분 동안 6084 x g에서 회전하여 세포를 수집합니다. 펠릿을 20mL의 얼음처럼 차가운 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁하고 1912 x g에서 4°C에서 20분 동안 다시 원심분리합니다. 상등액을 디캔팅하고 사용하기 전에 펠릿을 -20°C에서 동결합니다.
2. 니켈-니트릴로트리아세트산(Ni-NTA) 친화력 정제
   메모: 이 시점부터 샘플이 차가운지 확인하십시오.
   1. 40mL의 얼음-차가운 용해 완충액 L2(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl, 5% 글리세롤, 10mM 이미다졸, 10mM β-메르캅토에탄올)에 프로테아제 억제제(EDTA-free 정제, 재료 표 참조)를 추가하여 펠릿을 재현탁합니다. 초음파 처리 (60 % 진폭, 2 초 켜기 / 4 초 끄기, 8 분 켜기)를 통해 세포를 용해시킵니다. 4°C에서 23,426 x g에서 40분 동안 회전하여 용해물을 세척하고 정제를 위해 상층액을 계속합니다.
   2. 위의 원심분리 중에 Ni-NTA 수지를 준비합니다.
      1. 500μL의 균질화된 Ni-NTA 수지를 스탠딩 폴리프로필렌 크로마토그래피 컬럼에 옮기고 15분 동안 침전시킨 후 저장 용액이 배출되도록 합니다. 15mL의 초순수로 수지를 두 번 세척한 다음 15mL의 용해 버퍼 L2로 컬럼을 세척합니다.
   3. 1단계에서 제거된 세포 용해물의 상층액을 컬럼에 로드하고 통과시킵니다. 30mL의 세척 버퍼(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl, 5% 글리세롤, 20mM 이미다졸)로 컬럼을 세척합니다.
   4. 400μL의 용출 완충액(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl, 5% 글리세롤, 500mM 이미다졸)으로 단백질을 3회 용리합니다. 그런 다음 다른 300μL의 용리 버퍼로 용리를 반복합니다. 용리된 단백질을 700μL의 최종 부피로 결합합니다.
3. 겔 여과
   1. 겔 여과 완충액(50mM Tris, pH 7.5, 200mM NaCl, 5% 글리세롤)을 준비합니다. 겔 여과 완충액의 1 컬럼 부피(25 mL)로 크기 배제 컬럼을 세척합니다.
   2. 500 μL 루프를 사용하여 위의 700 μL 샘플을 로드하고 0.5 mL/분으로 실행한 다음 각 단백질을 포함하는 0.5 mL 부피의 2-3 분획을 수집합니다.
   3. 스핀 컬럼을 사용하여 각 단백질을 포함하는 분획을 결합 및 농축하고 Bradford 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.

3. ³²P 표지 pppGpp 및 ppGpp의 합성

1. 스크류 캡 튜브에서 소규모 Rel_seq 반응을 조립합니다(표 1 참조).
   메모: 방사성 시약은 허가된 장소에서만 개인 보호 장비와 함께 작업하십시오.
2. 37°C의 써모믹서에서 튜브를 1시간 동안 배양한 다음 95°C에서 5분 동안 얼음에 놓고 5분 동안 얼음에 놓습니다.침전된 단백질을 15,700 x g에서 5분 동안 스핀다운하고 상등액(합성된 ³²P-pppGpp)을 새 스크류 캡 튜브로 옮깁니다.
3. ³²P-pppGpp에서 ³²P-ppGpp를 합성하려면 ³²P-pppGpp 생성물의 절반을 새 스크류 캡 튜브로 옮기고 1μM GppA를 추가합니다. 튜브를 37°C에서 10분, 95°C에서 5분간 배양한 다음 얼음 위에 5분 동안 놓습니다.
4. 침전된 단백질을 15,700 x g에서 5분 동안 스핀다운하고 상등액(^{합성된 32}P-ppGpp)을 새 스크류 캡 튜브로 옮깁니다.
5. 1.5 M KH₂PO₄, pH 3.4를 이동상으로 사용하여 1 μL의 샘플을 박층 크로마토그래피(TLC) 플레이트(폴리에틸렌이민 변성 셀룰로오스 TLC 플레이트)에서 ^{실행하여 32}P-pppGpp 및 ³²P-ppGpp를 분석합니다.
   메모: ^α-32P-표지 구아노신 5'-트리포스페이트(³²P-α-GTP)를 대조군으로 사용합니다.
6. TLC 플레이트를 완전히 건조시키고 투명한 플라스틱 폴더 사이에 놓고 보관 형광체 스크린에 5분 동안 노출시킵니다. 인광분석기를 사용하여 신호를 시각화하고 정량화합니다.
   메모: ³²P-pppGpp 및 ³²P-ppGpp의 비율이 85%보다 높은 경우, 표 1을 사용하여 대규모 반응(500 μL, 20개의 96-웰 플레이트를 스크리닝하기에 충분)을 조립 및 합성할 수 있습니다.

4. (p)ppGpp의 표적 단백질에 대한 DRaCALA 스크리닝

1. 20μL의 전체 세포 용해물을 해동하여 96웰 V-bottom 마이크로타이터 플레이트로 옮깁니다. Serratia marcescens에서 엔도뉴클레아제 2.5 U/well을 첨가하고 37°C에서 15분 동안 배양하여 용해물 점도를 줄입니다. 용해물을 얼음 위에 20분 동안 놓습니다.
2. ³²P-pppGpp와 ³²P-ppGpp를 1:1 비율로 혼합하고 1x 용해 완충액 L1을 추가하여 (p)ppGpp의 최종 농도를 4nM.
   와 동일하게 만듭니다. 메모: pppGpp와 ppGpp의 화학적 유사성을 감안할 때 두 화학 물질을 혼합하면 스크리닝 프로세스가 단순화됩니다.
3. 멀티채널 피펫 및 여과된 피펫 팁을 사용하여 10μL의 (p)ppGpp 혼합물을 세포 용해물과 첨가하고 혼합합니다. 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다.
4. 96 x 핀 도구를 0.01% 비이온 세제 용액에 넣어 30초 동안 세척하고 티슈에 30초 동안 건조시킵니다. 핀 도구 3x 세척을 반복합니다.
5. 위의 96웰 샘플 플레이트에 핀 도구를 놓고 30초 동안 기다립니다. 핀 도구를 똑바로 들어 올려 니트로셀룰로오스 멤브레인에 30초 동안 똑바로 놓습니다.
   메모: spot이 누락된 경우 피펫과 여과된 팁으로 해당 샘플 중 2μL를 spoting합니다. 아래 표시된 대로 동일한 샘플의 중복 지점을 만드는 것이 좋습니다.
6. RT에서 멤브레인을 5분 동안 건조시킵니다. 투명한 플라스틱 폴더 사이에 멤브레인을 놓고 5분 동안 보관 형광체 스크린에 노출시킵니다. 형광체를 사용하여 시각화합니다.

5. 잠재적 표적 단백질의 정량화 및 식별

1. 인광광과 연결된 분석 소프트웨어를 사용하여 시각화된 플레이트의 .gel 파일을 엽니다. 배열 분석 기능을 사용하여 12개 열 x 8개 행으로 구성된 그리드를 설정하여 96개의 스폿을 정의합니다.
2. 전체 반점의 바깥쪽 가장자리를 둘러쌉니다(그림 1 참조). 정의된 큰 원의 Volumn+Background 및 Area를 내보내고 스프레드시트에 저장합니다.
   메모: 필요한 경우 각 개별 원의 위치를 변경하여 반점과 완벽하게 겹치도록 하고 각 원의 크기를 조정하여 실제 점보다 약간 더 크게 만듭니다.
3. 정의된 원의 크기를 줄여 작은 내부 점을 둘러쌉니다. Volumn+Background 및 정의된 작은 원의 영역을 내보내고 스프레드시트에 저장합니다.
4. 그림 1의 방정식을 사용하여 스프레드시트의 바인딩 분수를 계산하고 데이터를 플로팅합니다. 대부분의 다른 wells와 비교하여 높은 결합 분율을 보이는 wells에서 잠재적인 결합 단백질을 식별합니다.

표 1: ³²P-표지 pppGpp의 소규모 및 대규모 합성 반응에 대한 조립 정보.*10x Relseq 버퍼에는 250mM Tris-HCl, pH 8.6, 1M NaCl, 80mM MgCl₂가 포함되어 있습니다. 약어 : pppGpp = guanosine pentaphosphate.

개 의 개 분 명

	부피 (μL)
	소규모	대규모
초순수
Relseq 버퍼 10개*	2	50
ATP (8mM 최종)
렐<[> (4 μM 결승)
32P-α-구아노신 삼인산(GTP) (최종 120 nM) (주의)	0.2	5
합계	20	500

결과

그림 1: 결합 분획의 정량화 및 계산. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. 간단히 말해서, DRaCALA 반점은 전체 반점과 내부의 어두운 점(즉, 테스트된 단백질의 결합으로 인해 유지되는 (p)ppGpp)을 둘러싸는 두 개의 원을 그려 분석합니다. 특정 결합 신호는 비특이적 배경 신호(A₁ × ((S_{2-S 1})/(A_{2-A 1})))로 계산)을 뺀 후 내부 원(S₁)의 방사성 신호입니다. 결합 분획은 특정 결합 신호를 총 방사성 신호(S₂)로 나눈 값입니다. 약어: DRaCALA = Differential Radial Capillary Action of Ligan...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
32P-α-GTP	퍼키넬머	BLU006X250UC
96 x 핀 도구	V&P 사이언티픽	부통령 404	96 볼트 리플리케이터, 9mm 센터, 4.2mm 볼트 직경, 24mm 길이
96웰 V-바닥 마이크로타이터 플레이트	스테릴린	MIC9004	스테릴린 마이크로플레이트 V 웰 611V96
한천	옥소이드 - 써모 피셔	LP0011	한천 1호
ASKA 수집 균주	NBRP, 시겐, 일본		참조: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, pages 291–299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012
벤조나아제	시그마	E1014-25구	Serratia marcescens의 유전자 조작 엔도뉴클레아제
Bradford 단백질 분석 염료	바이오 라드	5000006	시약 농축액
디엠소	시그마	D8418	≥99.9%
DNase 1	시그마	DN25-1지
겔 여과10x300 컬럼	GE 헬스케어	28990944	방부제로 20% 에탄올 함유
글리세롤	PanReac AppliChem	122329.1214	분석용 글리세롤 87%
하이퍼카세트	아머샴	RPN 11647	20 × 40cm
이미다졸	시그마	56750	순도 p.a., ≥ 99.5% (GC)
IP 스토리지 형광체 스크린	후지필름	28956474	BAS-MS 2040 20x 40 cm
이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)	시그마	I6758	이소프로필 β-D-티오갈락토시드
용원 육수(LB)	Invitrogen - 써모 피셔(Thermo Fisher	12795027	Miller's LB 브로스 베이스
리소자임	시그마	엘4949	닭고기 달걀 흰자위에서; BioUltra, 동결건조 분말, ≥98%
MgCl2(염화마그네슘)	시그마	208337
MilliQ 워터			초순수
멀티채널 피펫	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	4661110	F1 - 클립 팁; 1-10 ul, 8 x 채널
염화나트륨	VWR 화학 물질	27810	AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.
Ni-NTA 아가로스	키아겐	30230
니트로셀룰로오스 블로팅 멤브레인	아머샴 프로트란	10600003	프리미엄 0.45 um 300 mm x 4 m
PBS (PBS)	옥소이드 - 써모 피셔	BR0014G	인산염 완충 식염수(Dulbecco A), 정제
PEG3350(폴리에틸렌 글리콜 3350)	시그마	202444
페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)	시그마	93482	페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드 용액 - 에탄올 (T)에 0.1 M
형광체 이미저	GE 헬스케어	28955809	태풍 FLA-7000 형광체 이미저
피펫 팁, 여과됨	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	94410040	ClipTip 12.5 μl 비멸균
Poly-Prep 크로마토그래피 컬럼	바이오 라드	7311550	폴리프로필렌 크로마토그래피 컬럼
프로테아제 억제제 미니	뚫다	A32955	정제, EDTA 무함유
스크류 캡 튜브	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	3488	마이크로 원심분리기 튜브, 2.0 ml, 스크류 캡 포함, 비멸균
SLS 96-deep 웰 플레이트	그라이너	780285	마스터블록, 2ML, PP, V-바텀, 내추럴
스핀 컬럼	밀리포어	UFC500396	Amicon Ultra -0.5ml 원심 필터
써모믹서	에펜도르프	5382000015	써모믹서 C
TLC 플레이트(PEI-셀룰로오스 F TLC 플레이트)	머크 밀리포어	105579	DC PEI-셀룰로오스 F (20 × 20cm)
트리스	시그마	BP152	분자 생물학을 위한 트리스 기초
트윈 20	시그마	P1379	점성 비이온 세제
β-메르캅토에탄올	시그마	M3148	99%(GC/적정)

년 ) ) 년 년 ) ) 건 (영문)