형광 프로브 이미징 분석: 반응성 산소종 유도 처리로 처리된 배양된 장 오가노이드 세포의 산화 스트레스를 시각화하는 기술

초록

출처: Stedman, A. et al., 반응성 산소 종 민감성 형광 프로브를 사용하여 쥐 장 오가노이드의 산화 스트레스 분석. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 배양된 오가노이드에서 산화 스트레스를 시각화하는 기술에 대해 설명합니다. 이 연구는 서로 다른 ROS 조절제로 처리한 후 오가노이드에 존재하는 다양한 세포 유형에서 ROS 축적으로 인한 산화 스트레스 수준을 이해하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 컨포칼 현미경에 의한 3D 오가노이드의 산화 스트레스 시각화

1. μ-Slide 8 웰 챔버에 도금된 오가노이드를 취하고 해당 웰에 1μL N-아세틸 시스테인 또는 NAC 원액을 첨가하여 1mM의 최종 농도를 얻습니다.
2. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 1 시간 동안 배양합니다.
3. 해당 웰에 1μL tBHP 원액을 첨가하여 200μM의 최종 농도를 얻습니다.
4. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 30 분 동안 배양합니다.
5. 형광 프로브의 1.25mM 희석액 중 웰당 1μL를 추가하여 5μM의 최종 농도를 얻습니다.
6. Hoechst의 1.25 mg/mL 희석액 중 웰당 1 μL를 첨가하여 5 μg/mL의 최종 농도를 얻습니다.
7. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 30 분 동안 배양합니다.
8. BMM을 방해하지 않고 매체를 제거합니다. 페놀 레드가 없는 따뜻한 DMEM 250μL를 부드럽게 추가합니다.
   메모: 장기 인수가 계획되어 있는 경우, 페놀 레드가 없는 DMEM에 성장 인자 화합물을 첨가하십시오.
9. 형광 프로브(ROS)를 감지하는 열 챔버와 ....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마우스
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2(Lgr5-GFP)	잭슨 연구소
성장배양 배지
고급 DMEM F12(DMEM/F12)	써모피셔	12634010
페니실린-스트렙토마이신(P/S)	써모피셔	15140122	재고 농도 : 100x (페니실린 10,000 units/mL 및 스트렙토마이신 10,000 μg/mL)
FLuoroBrite DMEM (DMEM 페놀 레드 없음)	써모피셔	A1896701
회스트: 33342	써모피셔	H3570	10 mg/mL의 재고
Matrigel 성장 인자 감소, Phenol Red Free (기저막 매트릭스)	코 닝	356231	냉장고에서 O/N을 해동한 후 얼음에 1시간 동안 보관하고 500mL 분취액을 만들어 -20°C에서 보관합니다
μ-Slide 8웰 챔버	이비디	80826
N-아세틸시스테인(NAC)	시그마	A9165
tert-부틸 하이드로퍼옥사이드(tBCHP) 용액(70%wt. H2O2에서)	시그마	458139
프로그램 및 장비
피지/ImageJ			https://imagej.net/software/fiji/ 다운로드 이미지 생성
옵저버.Z1	자이스		컨포칼 시스템
Opterra (스윕 필드 컨포칼)	브루커		컨포칼 시스템
고속 EMCCD 카메라 Evolve Delta 512	포토메트릭스		컨포칼 시스템
프리즘	GraphPad 소프트웨어		통계 분석

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