형광 프로브 이미징 분석: 반응성 산소종 유도 처리로 처리된 배양된 장 오가노이드 세포의 산화 스트레스를 시각화하는 기술

초록

출처: Stedman, A. et al., 반응성 산소 종 민감성 형광 프로브를 사용하여 쥐 장 오가노이드의 산화 스트레스 분석. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 배양된 오가노이드에서 산화 스트레스를 시각화하는 기술에 대해 설명합니다. 이 연구는 서로 다른 ROS 조절제로 처리한 후 오가노이드에 존재하는 다양한 세포 유형에서 ROS 축적으로 인한 산화 스트레스 수준을 이해하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 컨포칼 현미경에 의한 3D 오가노이드의 산화 스트레스 시각화

1. μ-Slide 8 웰 챔버에 도금된 오가노이드를 취하고 해당 웰에 1μL N-아세틸 시스테인 또는 NAC 원액을 첨가하여 1mM의 최종 농도를 얻습니다.
2. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 1 시간 동안 배양합니다.
3. 해당 웰에 1μL tBHP 원액을 첨가하여 200μM의 최종 농도를 얻습니다.
4. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 30 분 동안 배양합니다.
5. 형광 프로브의 1.25mM 희석액 중 웰당 1μL를 추가하여 5μM의 최종 농도를 얻습니다.
6. Hoechst의 1.25 mg/mL 희석액 중 웰당 1 μL를 첨가하여 5 μg/mL의 최종 농도를 얻습니다.
7. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 30 분 동안 배양합니다.
8. BMM을 방해하지 않고 매체를 제거합니다. 페놀 레드가 없는 따뜻한 DMEM 250μL를 부드럽게 추가합니다.
   메모: 장기 인수가 계획되어 있는 경우, 페놀 레드가 없는 DMEM에 성장 인자 화합물을 첨가하십시오.
9. 형광 프로브(ROS)를 감지하는 열 챔버와 가스 공급 장치가 장착된 컨포칼 현미경을 사용하여 오가노이드를 이미지화합니다.
   메모: 형광 프로브의 여기/방출(ex/em)은 644/665, Hoechst(핵)의 ex/em은 361/486, GFP(Lgr5-GFP 마우스의 장 줄기 세포)의 ex/em은 488/510입니다. 63x 오일 이멀젼 대물렌즈는 줄기 세포의 신호를 감지하는 데 사용됩니다. 샘플 간에 레이저 설정을 변경하지 마십시오. 20x 대물렌즈를 사용하여 ROS 생산에 대한 개요를 볼 수 있습니다.
10. 포지티브 컨트롤을 사용하여 ROS 신호에 대한 레이저 강도 및 시간 노출을 설정하고 이 신호가 네거티브 컨트롤에서 더 낮은지 확인합니다.
11. 접안렌즈를 사용하여 슬라이드를 스크리닝하여 레이저 강도를 발현하는 GFP 오가노이드를 식별하고 조정합니다.
    메모: 이 단계는 수동으로 수행됩니다.
12. 전체 오가노이드의 스티칭된 이미지를 얻기 위해 위치를 정의합니다. 25μm(단계 크기 5μm)의 z-스택을 설정하여 세포의 한 층을 보여주는 오가노이드 단면을 얻습니다.
    메모: 현미경 사용 설명서를 참조하여 설정을 최적화하십시오. 살아있는 세포를 사용하여 배양 종료 후 1시간 이내에 획득을 수행해야 합니다.
13. 오픈 소스 이미지 처리 소프트웨어에서 이미지를 엽니다(참고 자료 표 참조).
14. z-스택을 살펴보고 오가노이드의 중간이 잘 표현된 섹션을 선택하고 선택한 영역으로 새 이미지를 만듭니다.
15. 다음 단계에 따라 이미지를 수량화합니다.
    1. 자유형 선 도구를 선택합니다.
    2. 핵을 따라 선을 그립니다.
       메모: 줄기세포만 분석하는 경우 GFP 양성 세포를 나타내는 영역만 선택합니다.
    3. 발광 파편을 포함하지 않고 선으로 세포층을 덮도록 선 너비를 늘립니다.
    4. ROS 신호에 대한 채널을 선택하고 선택한 영역에서 형광 강도를 측정하고 값에 주석을 답니다.
    5. 신호가 없는 곳에 선을 긋고 이전 값에서 뺄 배경의 형광 강도를 측정하여 최종 강도를 얻습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마우스
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2(Lgr5-GFP)	잭슨 연구소
성장배양 배지
고급 DMEM F12(DMEM/F12)	써모피셔	12634010
페니실린-스트렙토마이신(P/S)	써모피셔	15140122	재고 농도 : 100x (페니실린 10,000 units/mL 및 스트렙토마이신 10,000 μg/mL)
FLuoroBrite DMEM (DMEM 페놀 레드 없음)	써모피셔	A1896701
회스트: 33342	써모피셔	H3570	10 mg/mL의 재고
Matrigel 성장 인자 감소, Phenol Red Free (기저막 매트릭스)	코 닝	356231	냉장고에서 O/N을 해동한 후 얼음에 1시간 동안 보관하고 500mL 분취액을 만들어 -20°C에서 보관합니다
μ-Slide 8웰 챔버	이비디	80826
N-아세틸시스테인(NAC)	시그마	A9165
tert-부틸 하이드로퍼옥사이드(tBCHP) 용액(70%wt. H2O2에서)	시그마	458139
프로그램 및 장비
피지/ImageJ			https://imagej.net/software/fiji/ 다운로드 이미지 생성
옵저버.Z1	자이스		컨포칼 시스템
Opterra (스윕 필드 컨포칼)	브루커		컨포칼 시스템
고속 EMCCD 카메라 Evolve Delta 512	포토메트릭스		컨포칼 시스템
프리즘	GraphPad 소프트웨어		통계 분석