출처: Stedman, A., et al., 반응성 산소 종 민감성 형광 프로브를 사용하여 쥐 장 오가노이드의 산화 스트레스 분석.J. Vis. 특급 (2021).
이 동영상은 GFP 발현 형질전환 마우스에서 얻은 3D 장 오가노이드의 ROS 수준을 정량화하기 위한 유세포 분석 분석을 보여줍니다. 이 방법은 ROS 생산에 대한 테스트 화합물의 효능을 조사하기 위한 체외 실험 모델을 제공합니다.
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방법 논문
산화 스트레스를 정량화하기 위한 유세포 분석 분석: 형량 탐침을 사용하여 장 오가노이드의 활성 산소 종을 정량화하기 위한 분석
1.4K 조회수
⸱
2025년 7월 8일
이 논문에서
초록
프로토콜
동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 장 오가노이드 배양을 위한 시약 및 재료 준비
- 성장 배양 배지를 준비하려면 글루타민 1개, 페니실린/스트렙토마이신(P/S) 용액 1개, HEPE 10mM, 쥐 EGF 50ng/mL, 쥐 Noggin 20μg/mL, 마우스 R-Spondin1 500ng/mL가 보충된 고급 DMEM/F-12를 혼합합니다(재료 표 참조). crypt가 추출되는 동안 배지를 실온(RT)으로 두십시오.
메모: 사용하지 않은 배지를 -20 °C에서 부분 표본으로 동결합니다.동결 및 해동을 피하십시오. - 50mL 튜브에 40mL의 Advanced DMEM/F-12를 채우고 얼음 위에 보관합니다.
메모: 사용하지 않은 매체는 4°C로 유지하십시오. 오가노이드 패시징에 사용됩니다. - 인큐베이터의 세포 배양 플레이트(96웰 둥근 바닥)를 37°C에서 예열합니다.
- 얼음 위에서 기저막 매트릭스(BMM)(재료 표 참조) 분취액을 해동합니다(프로토콜을 시....
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결과
그림 1: crypt 및 organoids의 대표 이미지.(A) EDTA를 사용한 첫 번째 배양 후 얻은 분획 F1의 예, 융모(정사각형)가 풍부하고 약간의 파편(별) 및 소낭선(원)이 있습니다. (B) crypts에서 농축된 분수 F4의 예. (C) 70 μm 세포 여과기(스케일 바, 200 μm)로 여과 후 얻어진 분리된 crypts만을 나타내는 현탁액. (D, E 및 F)입니다. 일반적인 오가노이드는 BMM(스케일 바, 100μm)에 crypt를 삽입한 후 각각 1일, 3일 및 5일 후에 얻어졌습니다.
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공개 사항
선언된 이해 상충이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 마우스 | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-크리어트2(Lgr5-GFP) | 잭슨 연구소 | ||
| 성장배양 배지 | |||
| 고급 DMEM F12(DMEM/F12) | 써모피셔 | 12634010 | |
| B-27 보충제, 비타민 A 제외 | 써모피셔 | 12587010 | 재고 집중도: 50x |
| 글루타맥스(글루타민) | 써모피셔 | 35050038 | 재고 집중도: 100x |
| 헤페스 | 써모피셔 | 15630056 | 재고 농도 : 1m |
| 쥐 EGF | R&D | 2028-EG-200 | 원료 농도: PBS에서 500μg/mL |
| 쥐 노긴 | R&D | 1967-NG/CF | 원료 농도: PBS에서 100 μg/mL |
| 쥐 R-spondin1 | R&D | 제3474-RS-050 | 원료 농도: PBS에서 50 μg/mL |
| N-2 보충제 | 써모피셔 | 17502048 | 재고 집중도: 100x |
| 페니실린-스트렙토마이신(P/S) | 써모피셔 | 15140122 | 재고 농도: 100x(페니실린 10,000 units/mL 및 스트렙토마이신 10,000 μg/mL) |
| 재료 | |||
| 70 μm 세포 스트레이너 | 코 닝 | 352350 | |
| 96웰 라운드 바닥 | 코 닝 | 3799 | |
| 볼 팁 시저 | 정밀 과학 도구 GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® 딥 레드 시약 | 써모피셔 | C10422 | |
| DAPI (4', 6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (불소 프로브) | 써모피셔 | D1306 (영어 | 10 mg/mL의 재고 |
| DPBS 1x 칼슘 없음 마그네슘 없음 (DPBS) | 써모피셔 | 14190144 | |
| Matrigel 성장 인자 감소, Phenol Red Free (기저막 매트릭스) | 코 닝 | 356231 | 냉장고에서 O/N을 해동한 후 얼음에 1시간 동안 보관하고 500mL 분취액을 만들어 -20°C에서 보관합니다 |
| N-아세틸시스테인(NAC) | 시그마 | A9165 | |
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