산화 스트레스를 정량화하기 위한 유세포 분석 분석: 형량 탐침을 사용하여 장 오가노이드의 활성 산소 종을 정량화하기 위한 분석

초록

출처: Stedman, A., et al., 반응성 산소 종 민감성 형광 프로브를 사용하여 쥐 장 오가노이드의 산화 스트레스 분석.J. Vis. 특급 (2021).

이 동영상은 GFP 발현 형질전환 마우스에서 얻은 3D 장 오가노이드의 ROS 수준을 정량화하기 위한 유세포 분석 분석을 보여줍니다. 이 방법은 ROS 생산에 대한 테스트 화합물의 효능을 조사하기 위한 체외 실험 모델을 제공합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 장 오가노이드 배양을 위한 시약 및 재료 준비

1. 성장 배양 배지를 준비하려면 글루타민 1개, 페니실린/스트렙토마이신(P/S) 용액 1개, HEPE 10mM, 쥐 EGF 50ng/mL, 쥐 Noggin 20μg/mL, 마우스 R-Spondin1 500ng/mL가 보충된 고급 DMEM/F-12를 혼합합니다(재료 표 참조). crypt가 추출되는 동안 배지를 실온(RT)으로 두십시오.
   메모: 사용하지 않은 배지를 -20 °C에서 부분 표본으로 동결합니다.동결 및 해동을 피하십시오.
2. 50mL 튜브에 40mL의 Advanced DMEM/F-12를 채우고 얼음 위에 보관합니다.
   메모: 사용하지 않은 매체는 4°C로 유지하십시오. 오가노이드 패시징에 사용됩니다.
3. 인큐베이터의 세포 배양 플레이트(96웰 둥근 바닥)를 37°C에서 예열합니다.
4. 얼음 위에서 기저막 매트릭스(BMM)(재료 표 참조) 분취액을 해동합니다(프로토콜을 시작하기 전 또는 crypt를 도금하기 최소 1시간 전).
   메모: BMM은 차갑게 유지하지 않으면 빠르게 굳어집니다.
5. DPBS(DPBS-P/S)에 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액을 첨가하여 세척/세척 용액을 준비합니다.
6. 100mm 페트리 접시에 10mL의 차가운 DPBS-P/S를 채웁니다. 6개의 15mL 튜브에 10mL의 DPBS를 채우고 F1에서 F6까지 레이블을 지정합니다.
7. DPBS에서 0.5M EDTA를 희석하여 10mM EDTA 용액 30mL를 준비합니다. 두 개의 15mL 튜브에 10mL의 10mM EDTA를 채우고 E1 및 E2라는 라벨을 붙입니다.
8. 모든 용액을 4°C로 예냉된 상태로 유지하고 시술 중에는 얼음 위에 보관하십시오.

2. 장 오가노이드 배양

1. 국가 규칙 및 규정에 따라 8-10주 된 Lgr5-EGFP-IRES-creERT2(Lgr5-GFP) 마우스를 희생하십시오.
2. 십이지장(위에서 5cm)과 회장(맹장에서 10cm) 사이의 영역을 둘러싸고 있는 제주눔의 5-8cm를 모아 얼음 위에 차가운 DPBS-P/S에 보관합니다.
3. 5-10mL의 차가운 DPBS-P/S.
   로 세척하여 장 내용물을 세척합니다. 메모: 집에서 만든 플러싱 주사기는 200μL 팁을 10mL 주사기 노즐에 연결하여 얻을 수 있습니다.
4. 볼팁 가위(재료 표 참조)를 사용하여 장을 세로로 엽니다(조직 손상을 방지하기 위해).
5. 집게를 사용하여 실온에서 차가운 DPBS-P/S가 들어 있는 페트리 접시에 조직을 옮기고 흔들어 헹굽니다.
6. 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 흡인으로 장을 잡고 10mL 차가운 10mM EDTA가 들어 있는 E1이라고 표시된 15mL 튜브로 옮깁니다.
7. 튜브를 3번 뒤집고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.
8. 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 10mL DPBS가 들어있는 튜브 F1의 조직을 옮깁니다. 2분 동안 소용돌이(정상적인 소용돌이에서는 튜브를 손으로 잡고 장이 잘 소용돌이치도록 합니다).
9. 분획 10μL를 페트리 접시에 넣고 현미경으로 분획의 품질을 평가합니다.
   메모: 모든 와류 단계는 최대 속도로 수행되며 각 분획의 품질은 현미경으로 평가해야 합니다(그림 1).
10. 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 흡인으로 장을 잡고 10mL DPBS와 와류가 포함된 튜브 F2에 2분 동안 전달합니다.
11. 2.10단계를 반복하여 10mL DPBS와 와류가 포함된 튜브 F3의 조직을 2분 동안 옮깁니다.
12. 2.6단계에서와 같이 EDTA 배양을 반복하여 10mM EDTA를 포함하는 튜브 E2의 조직을 옮깁니다.
13. 튜브를 3번 뒤집고 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.
14. 2.10단계를 반복하여 10mL DPBS와 와류가 포함된 튜브 F4의 조직을 3분 동안 옮깁니다.
15. 2.14단계를 반복하여 10mL DPBS와 와류가 포함된 튜브 F5의 조직을 3분 동안 옮깁니다.
16. 2.15단계를 반복하여 10mL DPBS와 와류가 포함된 튜브 F6의 조직을 3분 동안 옮깁니다.
17. 70μm 세포 여과기를 통해 중력에 의해 필터링되는 최량 분획을 50mL 튜브(얼음 위)에 결합하여 융모와 중요한 파편을 제거합니다.
    메모: 일반적으로 F5 및 F6은 수많은 crypt와 더 적은 파편을 포함하는 분획입니다.
18. 150 x g에서 4°C, 3분 동안 소굴을 돌립니다.
19. 튜브를 비우고 펠릿을 기계적으로 파괴한 다음 차가운 DMEM/F12 5mL를 추가합니다.
20. 현탁액 10μL를 페트리 접시에 넣고 현미경으로 분취량에 존재하는 crypt 수를 수동으로 계산합니다.
    메모: 단일 세포나 작은 파편을 세지 마십시오.
21. 웰당 300개의 crypt가 도금되어 있고, W는 well의 수, N은 10μL의 현탁액에서 계산된 crypt의 수를 고려하여 필요한 crypt 현탁액의 부피(V)를 μL 단위로 계산합니다. crypt를 새 15 mL tube.
    로 옮깁니다. 메모: V = 300 x W x 10/N. 계획된 실험에서 소량을 사용하는 경우 1.5mL 원심분리 튜브를 사용할 수 있습니다.
22. 200 x g에서 4°C에서 3분 동안 소굴을 돌립니다.
23. 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
24. 펠릿을 기계적으로 파괴하고 성장 배양 배지를 부드럽게 첨가하여 90crypts/μL의 농도를 얻습니다.
25. 희석되지 않은 BMM을 2부피 첨가하여 최종 농도가 30crypts/μL가 되도록 합니다. 혼합물에 기포가 유입되지 않도록 조심스럽게 위아래로 피펫팅합니다.
    메모: BMM 응고를 방지하기 위해 항상 튜브를 얼음 위에 두십시오.
26. 플레이트 10 μL의 crypts/BMM 혼합물을 각 웰에 넣습니다. 유세포 분석 분석의 경우 둥근 바닥 96웰 플레이트를 사용합니다. 각 웰의 중앙에 10μL를 돔으로 분포시킵니다.
    메모: 오가노이드를 이미징 분석을 위한 얇은 층으로 플레이트화하여 심층 이미징이 가능합니다.
27. BMM이 응고될 수 있도록 플레이트를 RT에서 5분 동안 그대로 둡니다. 플레이트를 37°C와 5% CO₂의 인큐베이터에 15분 동안 놓습니다.
28. BMM이 분리되지 않도록 주의하면서 각 웰에 250μL의 성장 배지를 추가합니다.
29. 플레이트를 37 ° C 및 5 % CO₂의 인큐베이터에 놓습니다.
30. 배양 4일차와 6일차 사이에 ROS 분석을 수행합니다. 그렇지 않으면 배지를 변경하고 여러 개의 긴 싹이 트는 구조가 나타난 후 죽은 세포가 오가노이드의 내강에 축적될 때 오가노이드를 분할합니다.

3. 오가노이드 패시징

1. 배양 6^일째부터 소장 오가노이드 패스시징을 시작하며, 이때는 유의미한 발아 구조가 형성되고 오가노이드의 내강이 어두워집니다.
   메모: 오가노이드의 내강은 죽은 세포, 파편 및 점액의 축적으로 인해 어두워집니다. 쪼개지기 전에 오가노이드가 과도하게 자라지 않도록 합니다. 분할 비율은 오가노이드의 성장에 따라 다릅니다. 오가노이드를 6일째에 1:2, 10일째에 1:3의 비율로 전달하는 것이 좋습니다.
2. 15mL 튜브에 차가운 Advanced DMEM/F-12 4mL를 채우고 얼음 위에 보관하십시오.
   메모: 여기에는 96웰 배양 플레이트의 부피가 제공됩니다. 다른 형식을 사용하는 경우 그에 따라 볼륨을 조정하십시오.
3. BMM 돔을 건드리지 않고 우물에서 피펫 또는 진공 펌프로 매체를 조심스럽게 흡인하고 폐기하십시오.
4. 웰당 100μL의 Cold Advanced DMEM/F-12를 추가합니다. 피펫을 위아래로 움직여 BMM을 부수고 웰의 내용물을 15mL 튜브로 옮깁니다.
5. 200μL의 차가운 Advanced DMEM/F-12로 웰을 세척하고 동일한 튜브에 수집합니다.
   메모: 동일한 실험 조건에서 여러 웰을 패시징하는 경우 웰의 내용물을 동일한 15mL 수집 튜브에 모을 수 있습니다.
6. 15mL 수집 튜브를 100 x g에서 4°C에서 5분 동안 돌립니다.
7. 상등액을 버리고 펠릿에 1mL의 차가운 Advanced DMEM/F-12를 추가합니다. P1000 팁을 사용하여 P10 팁(필터 없음)을 들어 올려 위아래로 최소 20회 반복합니다.
8. 튜브에 차가운 Advanced DMEM/F-12 4mL를 추가합니다. 300 x g에서 4°C에서 5분간 회전합니다.
9. 펠릿을 방해하지 않고 피펫 또는 진공 펌프로 상층액을 흡입하십시오. 그런 다음 펠릿을 기계적으로 파괴하십시오.
10. 성장배양액에 희석된 BMM을 첨가한다(2:1 비율). 혼합물에 기포가 유입되지 않도록 조심스럽게 위아래로 피펫팅합니다.
11. 플레이트 10 μL의 crypts/BMM 혼합물을 각 웰에 넣습니다.
12. BMM이 응고될 수 있도록 플레이트를 RT에서 5분 동안 유지합니다. 플레이트를 37°C와 5% CO₂의 인큐베이터에 15분 동안 놓습니다.
13. 각 웰에 250μL의 성장 배지를 추가합니다
    메모: BMM을 분리하지 않도록 주의하십시오.
14. 플레이트를 37 ° C 및 5 % CO₂의 인큐베이터에 놓습니다.

4. 장 오가노이드의 산화 스트레스를 평가하기 위한 시약 및 재료 준비

1. 억제제 N-아세틸시스테인(NAC)의 250mM 원액을 준비하고(재료 표 참조) 10mg을 245μL의 DPBS로 재현탁합니다. 1mM 최종 농도에서 사용합니다.
2. 70%의 물에 70%의 유도제 Tert-butyl hydroperoxide(tBHP)의 50mM 원액을 준비하고 3.22μL를 496.8μL의 DPBS로 희석합니다. 200μM 최종 농도에서 사용합니다.
3. 유세포 분석 연구를 위해 DMSO에서 원액을 1/10 희석하여 형광 프로브의 250μM 작업 용액(재료 표 참조)을 준비합니다. 1μM 최종 농도에서 사용 .
   메모: 제조업체의 지침에 표시된 바와 같이 형광 프로브는 빛과 산소에 민감합니다. 주식과 부분 표본은 너무 많이 열고 닫아서는 안 됩니다.
4. 유세포 분석 분석에서 사체 세포 식별에 사용할 DPBS에서 0.1 μg/mL DAPI의 최종 용액을 준비합니다.
   메모: 이 단계에서는 그림 2A에 표시된 조건을 사용하여 모든 분석에 포함되어야 하는 음성 및 양성 대조군을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 분석은 항산화 또는 전산화 화합물을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 단계는 동일하며 유일한 차이점은 형광 염료를 사용하기 전에 화합물을 첨가하는 경우입니다.

5. 유세포 분석기를 사용한 해리된 오가노이드에 대한 산화 스트레스의 정량화

1. 음성 대조군을 위해 웰에 1μL NAC 원액을 추가하여 1mM.
   의 최종 농도를 얻습니다. 메모: 96웰 둥근 바닥 플레이트에 도금된 오가노이드를 사용합니다.
2. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 1 시간 동안 배양합니다.
3. 해당 웰에 1μL tBHP 원액을 첨가하여 200μM의 최종 농도를 얻습니다.
4. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 30 분 동안 배양합니다.
5. 멀티채널 피펫을 사용하여 부착된 BMM을 방해하지 않고 매체를 제거하고 다른 96웰 원형 바닥 플레이트로 옮깁니다. 이 접시를 따로 보관하십시오.
6. 100μL의 트립신을 첨가하고 멀티채널 피펫을 사용하여 피펫을 5회 이상 위아래로 움직여 BMM을 파괴합니다.
7. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 5 분 이상 배양하지 마십시오.
8. 멀티채널 피펫을 사용하여 오가노이드를 해리하기 위해 최소 5회 위아래로 피펫팅합니다.
9. RT에서 300 x g로 5분 동안 회전합니다.
10. 플레이트를 뒤집어 상등액을 폐기하십시오. 6.3단계에서 수집한 배지를 해당 웰에 다시 추가하고 위아래로 5회 피펫팅하여 세포를 재현탁합니다.
11. 최종 농도 1μM에서 형광 프로브를 추가합니다. 250μM 희석액에서 웰당 1μL를 추가하고 37°C 및 5% CO₂.
    에서 30분 동안 배양합니다. 메모: 기기 설정에 필요한 웰에 형광 프로브를 추가하지 마십시오(그림 2B).
12. RT에서 300 x g로 5분 동안 회전합니다.
13. 250μL의 0.1μg/mL DAPI 용액으로 세포를 재현탁합니다. 샘플을 적절한 유세포 분석 튜브에 옮기고 튜브를 얼음 위에 보관한 다음 분석을 진행합니다.
    메모: 기기 설정에 필요한 웰에 DAPI 대신 PBS를 추가합니다(그림 2B).
14. mono-stained 샘플을 사용하여 각 형광단에 대한 염색되지 않은 제어 및 레이저 전압에 대한 순방향 및 측면 산란 전압 설정을 최적화합니다.
15. 적절한 게이팅 전략(그림 3A)을 사용하여 최소 20,000개의 이벤트를 수집합니다.
    참고: 50,000개의 이벤트가 선호됩니다. 자세한 획득 설정은 사용하는 기기에 따라 다릅니다.

결과

그림 1: crypt 및 organoids의 대표 이미지.(A) EDTA를 사용한 첫 번째 배양 후 얻은 분획 F1의 예, 융모(정사각형)가 풍부하고 약간의 파편(별) 및 소낭선(원)이 있습니다. (B) crypts에서 농축된 분수 F4의 예. (C) 70 μm 세포 여과기(스케일 바, 200 μm)로 여과 후 얻어진 분리된 crypts만을 나타내는 현탁액. (D, E 및 F)입니다. 일반적인 오가노이드는 BMM(스케일 바, 100μm)에 crypt를 삽입한 후 각각 1일, 3일 및 5일 후에 얻어졌습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마우스
Lgr5-EGFP-IRES-크리어트2(Lgr5-GFP)	잭슨 연구소
성장배양 배지
고급 DMEM F12(DMEM/F12)	써모피셔	12634010
B-27 보충제, 비타민 A 제외	써모피셔	12587010	재고 집중도: 50x
글루타맥스(글루타민)	써모피셔	35050038	재고 집중도: 100x
헤페스	써모피셔	15630056	재고 농도 : 1m
쥐 EGF	R&D	2028-EG-200	원료 농도: PBS에서 500μg/mL
쥐 노긴	R&D	1967-NG/CF	원료 농도: PBS에서 100 μg/mL
쥐 R-spondin1	R&D	제3474-RS-050	원료 농도: PBS에서 50 μg/mL
N-2 보충제	써모피셔	17502048	재고 집중도: 100x
페니실린-스트렙토마이신(P/S)	써모피셔	15140122	재고 농도: 100x(페니실린 10,000 units/mL 및 스트렙토마이신 10,000 μg/mL)
재료
70 μm 세포 스트레이너	코 닝	352350
96웰 라운드 바닥	코 닝	3799
볼 팁 시저	정밀 과학 도구 GMBH	14086-09
CellROX® 딥 레드 시약	써모피셔	C10422
DAPI (4', 6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (불소 프로브)	써모피셔	D1306 (영어	10 mg/mL의 재고
DPBS 1x 칼슘 없음 마그네슘 없음 (DPBS)	써모피셔	14190144
Matrigel 성장 인자 감소, Phenol Red Free (기저막 매트릭스)	코 닝	356231	냉장고에서 O/N을 해동한 후 얼음에 1시간 동안 보관하고 500mL 분취액을 만들어 -20°C에서 보관합니다
N-아세틸시스테인(NAC)	시그마	A9165
tert-부틸 하이드로퍼옥사이드(tBCHP) 용액(70%wt. H2O2에서)	시그마	458139
TrypLE Express Enzyme (1X), 페놀 레드 없음 (트립신)	써모피셔	12604013
초순수 0.5 M EDTA, pH8.0	써모피셔	15575020
Y-27632	시그마	Y0503	조직 해리 시 세포 사멸을 최소화하기 위해 사용되는 암석 억제제
프로그램 및 장비
Attune NxT (유세포 분석기)	테르모피셔		유세포 분석기
플로우조	BD 생명과학		FACS 분석
프리즘	GraphPad 소프트웨어		통계 분석

호 년 년 ) .