SUMOylation Assay: 면역블로팅을 통해 기질 단백질의 SUMOylation 상태를 검출하는 In vitro 기술

초록

출처: Yang, W. S. et al., SUMO E3 리가아제 활성을 연구하기 위한 체외 SUMOylation Assay. J. Vis. 특급 (2018)

이 동영상은 순차 효소 캐스케이드를 사용하여 기질 단백질의 SUMOylation을 위한 in vitro 방법을 보여줍니다. 또한, 단백질의 SUMOylated 상태는 전기영동 및 면역블로팅 기술을 사용하여 식별됩니다.

프로토콜

1. 바큘로바이러스 발현 구조체의 준비

1. K-bZIP의 cDNA를 N-말단 에피토프 태그가 있는 이중 발현 바큘로바이러스 벡터(재료 표 참조)로 클로닝하여 SUMO E3 리가제 K-bZIP을 정제합니다. 우리는 옥타펩타이드 태그(프로토콜 전체에서 vector-tag-K-bZIP으로 표시됨)를 사용하여 성공을 거두었습니다.
   메모: K-bZIP 중합효소 연쇄 반응(PCR) 클로닝을 위한 DNA 템플릿은 독시사이클린 처리 후 TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 세포에서 분리된 RNA에서 cDNA 역전사입니다.
   1. full-length K-bZIP cDNA를 CpoI 클로닝 부위를 사용하여 이중 발현 벡터로 전달합니다. 심폐소인수인척(CPI는 PCR 산물과 이중 발현 벡터의 1μg을 37°C에서 3시간 동안 분해합니다.
   2. 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동 후 분해된 DNA를 분리하고 추출합니다. 제조업체의 지침에 따라 16°C에서 30분 동안 T4 DNA 리가제로 인서트(K-bZIP) 및 벡터를 접합합니다(재료 표 참조).
   3. 1.5 mL 튜브에 50 μL 수용 대장균 세포 "A"(재료 표 참조)에 5 μL의 ligation DNA를 추가합니다. 얼음에 30분 동안 올려 놓습니다. 그런 다음 1.5mL 튜브를 42°C 수조에서 45초 동안 배양한 후 즉시 튜브를 얼음 위에 3분 동안 놓습니다.
   4. 600 μL S.O.C. 배지(0.5%(w/v) 효모 추출물, 2%(w/v) 트립톤, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 20mM MgSO₄ 및 4%(w/v) 포도당)을 튜브에 넣고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브를 실온에서 600 x g으로 3분 동안 원심분리합니다.
   5. 상층액을 제거하고 펠릿을 60μL Luria-Bertani 배지(LB, 1%(w/v) 트립톤, 0.5%(w/v) 효모 추출물 및 85mM NaCl)로 재현탁하고 100μg/mL 암피실린이 포함된 LB 한천 플레이트에 펴 바릅니다. 한천 플레이트를 37 ° C에서 16 시간 동안 배양합니다.
   6. 100μg/mL 암피실린을 함유한 5mL LB 배지에 접종할 콜로니 1개를 선택하고 250rpm 진탕으로 37°C에서 16시간 동안 배양합니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 plasmid 추출 키트로 plasmid, vector-tag-K-bZIP을 추출합니다(Table of Materials(재료표 참조).
2. vector-tag-K-bZIP을 유능한 대장균 세포 "B"로 변환하여 tag-K-bZIP을 품고 있는 재조합 bacmid를 생성합니다(재료 표 참조).
   1. 0.2 μg vector-tag-K-bZIP 플라스미드와 100 μL competent E를 혼합합니다.1.5mL 튜브에 대장균 세포 "B"를 넣고 30분 동안 얼음 위에 올려 놓습니다. 튜브를 42°C 수조에서 45초 동안 배양한 후 즉시 튜브를 얼음 위에 올려 3분 동안 놓습니다.
   2. 900μL의 S.O.C. 배지를 튜브에 넣고 37°C에서 50rpm으로 회전하면서 4시간 동안 배양합니다. 다음으로, 배지 10 μL를 취하고, 50 μg/mL 카나마이신, 7 μg/mL 겐타마이신, 10 μg/mL 테트라사이클린, 100 μg/mL 갈락토시다아제 기질 및 40 μg/mL 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 포함하는 LB 한천 플레이트에 펴 바르기 위해 추가로 50 μL의 S.O.C 배지를 첨가하고, 37 ° C에서 48 시간 동안 플레이트를 배양합니다.
   3. 50μg/mL 카나마이신, 7μg/mL 겐타마이신 및 10μg/mL 테트라사이클린을 함유한 5mL LB 배지에 흰색 집락 1개를 접종합니다. 37 ° C에서 250 rpm 쉐이크로 16 시간 동안 배양합니다.
   4. tag-K-bZIP이 있는 재조합 bacmid DNA를 분리하고, 정량화한 후 1 μg/μL의 농도로 재현탁합니다.
3. tag-K-bZIP을 포함하는 1μg의 재조합 bacmid DNA를 6-well plate의 1 well에 있는 Sf9 세포에 transfection하여 tag-K-bZIP을 발현하는 재조합 baculoviruses를 생성합니다.
   1. 6웰 플레이트의 각 웰에 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 겐타마이신이 공급된 2mL Grace's Insect Medium에 2 x 10⁶ Sf9 세포(재료 표 참조)를 시드한 다음 27°C에서 1시간 동안 배양합니다.
   2. 140rpm의 궤도 현탁액에서 27°C에서 10% FBS, 1% 겐타마이신 및 1% 세제 C(재료 표 참조)와 함께 공급되는 Grace의 곤충 배지에서 Sf9 세포의 로그 상 배양을 유지합니다. 혈구계와 트리판 블루 염색을 사용하여 세포를 세십시오. 세포 생존율은 95%를 초과해야 합니다. 2-3일마다 1:3의 subcultivation ratio를 사용하여 세포를 유지합니다(최소 밀도 ~0.5 x 10,⁶ cells/mL).
   3. 2 μL bacmid DNA(1 μg/μL) 및 98 μL 환원된 혈청 배지(재료 표 참조)를 2 mL 튜브에 추가합니다. 그런 다음 튜브에 4μL transfection 시약(재료 표 참조)을 추가하고 잘 혼합합니다. 실온에서 15분 동안 배양합니다.
   4. 이 transfection 혼합물(104 μL)을 각 웰에 첨가하고 27 °C에서 12-16 시간 동안 배양합니다.
   5. 소진된 배지를 부드럽게 흡인하여 제거하고 10% FBS와 1% 겐타마이신이 함유된 신선한 Grace's Insect Medium 2mL로 교체합니다. Sf9 세포는 플레이트 표면에 느슨하게 부착되며 부드러운 흡인으로 방해받지 않습니다.
4. transfection 후 재조합 바큘로바이러스를 수집하고 바큘로바이러스를 증폭하여 추가 실험을 위한 고역가 스톡(P1)을 얻습니다.
   1. 배지를 교체한 후 72시간 후, 멸균 세포 리프터를 사용하여 Sf9 세포를 긁어내고, 1.5mL 튜브에 각 개별 웰에서 상등액을 수집하고, 10초 동안 와류시킵니다.
   2. 4°C에서 150 x g에서 3분간 원심분리기. 상층액을 P0 바큘로바이러스로 수집하고 1.5mL 튜브(각 튜브에 1mL 바큘로바이러스)에서 분취량을 수집합니다. -80 °C에서 보관하십시오.
   3. 10cm 페트리 접시에 10% FBS 및 1% 겐타마이신이 공급된 10mL Grace's Insect Medium에 1 x 10⁷ Sf9 세포를 시드하고 27°C에서 1시간 동안 배양합니다.
   4. tag-K-bZIP을 발현하는 재조합 바큘로바이러스의 증폭을 위해 seed된 Sf9 세포에 0.5mL P0 바큘로바이러스를 첨가하고 27°C에서 48시간 동안 배양합니다.
   5. 15 mL tube에 상등액을 P1 baculovirus로 채취하여 4 °C에서 최대 1개월까지 보관합니다.

2. K-bZIP 정제

1. 1.3.2단계에서 설명한 대로 140rpm의 궤도 현탁액에서 27°C에서 10% FBS, 1% 겐타마이신 및 1% 세제 C와 함께 공급되는 Grace's Insect Medium에서 Sf9 세포의 로그 상 배양을 유지합니다.
2. transduction 당일, 1mL의 바큘로바이러스 함유 상등액(P1)을 2 x 10⁶ cells/mL 밀도의 Sf9 세포 250mL에 첨가합니다.
3. 140rpm 쉐이킹으로 오비탈 쉐이커에서 27°C에서 72시간 동안 Sf9 세포를 배양한 다음 4°C에서 15분 동안 2,740 x g에서 원심분리로 수집합니다.
4. 10mL 용해 완충액(20mM HEPES pH 7.9, 0.5M NaCl, 1% 세제 A(재료 표 참조), 2% 글리세롤, 프로테아제 억제제 칵테일)에서 상등액 및 용해 세포 펠릿을 제거하고 현탁액 믹서를 사용하여 4°C에서 30분 동안 50rpm으로 회전합니다.
5. 원심분리기 세포를 15,000 x g에서 15분 동안 용해하여 상층액을 수집합니다.
6. tag-K-bZIP을 정제하기 위해 14mL 폴리프로필렌 튜브에서 50μL의 항체 태그 마그네틱 비드로 세포 용해물(10mL)을 배양하고 현탁 믹서를 사용하여 4°C에서 3시간 동안 50rpm으로 회전합니다. 단백질 포획 후 비드를 800 x g 원심분리에서 4°C에서 30초 동안 펠렛화합니다. 대부분의 상등액을 제거하고 약 1mL의 잔류 부피로 비드를 다시 현탁시킨 다음 세척을 위해 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
7. 비드가 들어 있는 튜브를 마그네틱 스탠드에 올려 포획된 단백질을 세척하고, 마그네틱 비드가 튜브 측면에 완전히 부착되면 상층액을 제거합니다.
8. 용해 완충액으로 비드를 4번 세척합니다.
   1. 1.5mL 튜브에 1mL 용해 완충액을 추가하고 튜브를 10회 반전시킵니다. 1.5mL 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 2.7에 설명된 대로 상층액을 제거합니다.
   2. 이전 단계를 3회 더 반복합니다.
9. 인산염 완충 식염수(PBS)로 비드를 한 번 세척합니다.
   1. 1.5mL 튜브에 1mL PBS(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 8mM Na2HPO₄, 1.5mM KH_2PO4)를 넣고 튜브를 10회 반전시킵니다.
   2. 1.5mL 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 상층액을 제거합니다.
10. PBS에서 희석된 150μg/mL 옥타펩타이드 100μL를 1.5mL 튜브에 첨가하여 항체 태그가 지정된 마그네틱 비드에서 태그-K-bZIP 단백질을 용리합니다. 실온에서 서스펜션 믹서로 50rpm으로 튜브를 10분 동안 회전합니다. 그런 다음 튜브를 마그네틱 스탠드에 다시 놓고 깨끗한 1.5mL 튜브에 K-bZIP 함유 상층액을 수집합니다.
11. SDS-PAGE에 의해 1-5 μL 정제된 tag-K-bZIP 단백질을 분석한 후 Coomassie blue 염색을 수행합니다. 동일한 겔에 2μg, 1μg 및 0.5μg의 소 혈청 알부민(BSA) 샘플을 로드하고 ImageJ와 같은 이미지 처리 프로그램으로 정량화에 사용합니다. BSA 표준과 비교하여 K-bZIP 농도를 추정합니다.
12. 정제된 K-bZIP은 이제 각 SUMOylation 분석에 사용할 준비가 되었습니다. PBS의 K-bZIP을 최종 농도 100ng/μL로 희석하고 -80°C의 작은 부분 표본에 보관합니다.

3. SUMOylation 분석

1. 3 μL의 100 ng/μL의 정제된 tag-K-bZIP을 각 in vitro SUMOylation 반응의 마스터 믹스에 추가합니다. 마스터 믹스의 성분에는 1 μL 단백질 완충액, 1x SUMOylation 완충액, 0.5 μL p53 단백질(0.5 mg/mL), 25 nM의 E1 활성화 효소(원료 계수: 1 μM), 50 nM의 E2 접합 효소(원료 계수: 10 μM) 및 각 250 nM의 SUMO 펩타이드(SUMO-1, SUMO-2 또는 SUMO-3, 원료 계수)가 포함되어 있습니다. 5 μM)을 17 μL의 최종 부피로 끌어 올립니다.
2. 내용물을 부드럽게 혼합하고 30 ° C에서 3 시간 동안 반응을 배양합니다.20 μL의 2x SDS-PAGE 로딩 버퍼 (100 mM Tris-HCL pH 6.8, 4 % 도데 실 황산나트륨, 0.2 % (w / v) 브로 모페놀 블루, 20 % (v / v) 글리세롤 및 200 mM β-메르 캅토 에탄올)을 첨가하고 95 ° C에서 5 분 동안 샘플을 변성시킵니다.
3. SDS-PAGE에서 샘플을 분리하고, 반건조 전기영동 전달 장치를 사용하여 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮기고, 안티 p53 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 분석합니다.
   1. 겔 장치를 설정하고 20μL의 샘플을 겔 웰에 로드합니다.
   2. 10% 젤을 80V의 정전류에서 약 120분 동안 실행합니다(염료 밴드가 젤 바닥에 도달할 때까지). 전기영동이 완료되면 전원을 끕니다.
   3. 겔 장치와 겔 카세트를 분리하여 겔을 꺼내고 겔을 반건조 전달 버퍼(48mM Tris-HCl, 39mM 글리신, 20% 메탄올)에 5분 동안 띄웁니다.
   4. 다른 용기를 가지고 PVDF 멤브레인을 메탄올에 1분 동안 담급니다. 그런 다음 메탄올에서 PVDF를 꺼내 반건조 전달 버퍼에 넣습니다. 멤브레인을 5분 동안 부드럽게 저어줍니다.
   5. 반건식 전기영동 장치의 안전 커버를 제거합니다.
   6. 여과지를 미리 적시고 여과지, PVDF 멤브레인, 젤 및 여과지와 같이 하단 백금 양극에 젤 샌드위치를 준비합니다.
   7. 음극판과 안전 커버를 고정한 다음 15V 정전류에서 90분 동안 블롯을 실행합니다. 전원을 끄고 반건조 장치를 분리한 다음 PVDF 멤브레인을 꺼냅니다.
   8. 차단 완충액(TBST 완충액의 5% 무지방 우유(137mM NaCl2, 20mM Tris-HCl, 0.1% 세제 B(재료 표 참조), pH 7.6))으로 실온에서 1시간 동안 오비탈 쉐이커에 의한 30rpm 진탕으로 PVDF 멤브레인을 차단합니다.
   9. PVDF 멤브레인을 차단 완충액에 희석된(1:1,000) 항-p53 항체와 4°C에서 12-16시간 동안 현탁 믹서를 사용하여 30rpm 쉐이킹으로 하이브리드화합니다.
   10. PVDF 멤브레인을 용기에 꺼내 TBST에 넣습니다. PVDF 멤브레인을 TBST로 두 번 더 헹굽니다.
   11. PVDF 멤브레인을 TBST에 30분 동안 담그고 오비탈 쉐이커로 45rpm 진탕합니다.
   12. PVDF 멤브레인을 서양고추냉이 과산화효소(HRP)로 희석(1:4,000)한 차단 버퍼로 1시간 동안 실온에서 현탁 믹서를 사용하여 30rpm 진탕으로 접합한 항토끼 항체와 하이브리드화합니다.
   13. PVDF 멤브레인을 3.4.10단계에 설명된 대로 TBST로 3회 세척합니다.
   14. 서스펜션 믹서를 사용하여 30rpm 쉐이킹으로 TBST에 PVDF 멤브레인을 45분 동안 담그십시오. TBST를 제거하고 PBS를 추가하여 PVDF 멤브레인을 4°C에서 최대 12시간 동안 보존합니다.
   15. 향상된 화학발광 기질(ECL 기질) 시약 1 및 2(1:1)를 혼합합니다(재료 표 참조). PBS에서 PVDF 멤브레인을 제거하고 종이 타월 또는 경량 와이퍼로 잠시 닦아내어 과도한 수분을 흡수한 다음 즉시 400μL의 ECL 시약을 각 멤브레인 표면에 3-5분 동안 첨가합니다. 잠시 블로팅하여 과도한 ECL 시약을 제거하되 멤브레인이 완전히 건조되지 않도록 합니다.
   16. 발광 이미징 시스템 또는 자동 방사선 촬영 필름을 사용하여 블롯을 노출시킵니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
pFastBac	인비트로젠	제10359-016	이중 발현 baculovirus vector
pCR2.1-TOPO 벡터	인비트로젠		PCR 산물 벡터
수용 세포 E. coli DH5α	이이스턴 바이오텍	파이678-80VL	유능한 대장균 세포 A
대장균 DH10Bac	인비트로젠	제10359-016	유능한 대장균 세포 B
푸게네HD	로슈	4709705001	Transfection 시약
옵티-MEM	지브코	31985062	저혈청 배지
T4 리가아제	뉴잉글랜드 바이오랩스	M0202S
CpoI(RsrII)	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	ER0741
블루올	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	나1690	갈락토시다아제 기질
증권 시세	시그마-알드리치	I6758-1G
그레이스의 곤충 매체	지브코	11605094
소 태아 세럼	지브코	10082147
겐타마이신	써모 피셔	15750060
암피실린	시그마-알드리치	A9393-25G
카나마이신	시그마-알드리치	K0254-20ML
겐타마이신	지브코	제15710-064
테트라사이클린	시그마-알드리치	87128-25지
LB 국물	머크	1.10285.0500
헤페스	시그마-알드리치	H4034-100지
염화나트륨	시그마-알드리치	S9888-5KG
케이클	머크	1.04936.1000
나2HPO4	시그마-알드리치	S5136-500G
KH2사서함4	J.T.베이커	3246-01
나트륨 도데 실 설페이트	머크	1.13760.1000
β-메르캅토에탄올	바이오 라드	Tel.: 161-0710
트리스(기본)	J.T.베이커	4109-06
무지방 우유	폰테라
글리세롤	J.T.베이커	2136-01
트리톤 X-100	암레스코	0694-1패	세제 A
트윈 20	암레스코	0777-500ML	세제 B
Poloxamer 188 용액	시그마-알드리치	P5556-100ML	세제 C
프로테아제 억제제 칵테일 정제	로슈	전화 04 693 132 001
3x 플래그 펩타이드	시그마	F4799
anti-FLAG m2 마그네틱 비드	시그마-알드리치	M8823	항체 태그가 붙은 마그네틱 비드
SUMOlink SUMO-1 키트	액티브 모티프	40120	표준 SUMOylation 프로토콜
SUMOlink SUMO-2/3 키트	액티브 모티프	40220	표준 SUMOylation 프로토콜
QIAquick 젤 추출 키트	키아젠	28704
QIAGEN 플라스미드 미니 키트	키아젠	12123	플라스미드 추출 키트
폴리프로필렌 튜브	송골매	352059
페트리 접시	송골매	351029
세포 리프터	코 닝	CNG3008
로딩 팁	소렌슨 바이오사이언스	28480
증권 시세	퍼킨엘머	NEF1002
여과지 취합	바이오 라드	1703932
미니 슬래브 겔 장치 (Bio-Rad Mini Protean II Cell)	바이오 라드	1658001 에듀
Trans-Blot SD 반건조 전기영동 전사 셀	바이오 라드	1703940
피어스 ECL 웨스턴 블로팅	열	32106	ECL 시약
서스펜션 믹서	Digisystem 실험실 기기 Inc.	SM-3000
오비탈 셰이커	캔신 악기 (주)	운영체제701
이미지퀀트 LAS 4000	GE 헬스케어	28955810
생체 분자 이미저	GE 헬스케어	28955810
SF9	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	B82501
anti-p53 항체	세포 신호 전달	#의 9282
항토끼 항체	GE 헬스케어	NA934-1ML

호 호 ) ) 년 표시기 호 년 년 년 년 년 년 년 표시기 님 시리즈 )