출처: Yang, W. S. et al., SUMO E3 리가아제 활성을 연구하기 위한 체외 SUMOylation Assay. J. Vis. 특급 (2018)
이 동영상은 순차 효소 캐스케이드를 사용하여 기질 단백질의 SUMOylation을 위한 in vitro 방법을 보여줍니다. 또한, 단백질의 SUMOylated 상태는 전기영동 및 면역블로팅 기술을 사용하여 식별됩니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
SUMOylation Assay: 면역블로팅을 통해 기질 단백질의 SUMOylation 상태를 검출하는 In vitro 기술
1.2K 조회수
⸱
2025년 7월 8일
이 논문에서
초록
프로토콜
1. 바큘로바이러스 발현 구조체의 준비
- K-bZIP의 cDNA를 N-말단 에피토프 태그가 있는 이중 발현 바큘로바이러스 벡터(재료 표 참조)로 클로닝하여 SUMO E3 리가제 K-bZIP을 정제합니다. 우리는 옥타펩타이드 태그(프로토콜 전체에서 vector-tag-K-bZIP으로 표시됨)를 사용하여 성공을 거두었습니다.
메모: K-bZIP 중합효소 연쇄 반응(PCR) 클로닝을 위한 DNA 템플릿은 독시사이클린 처리 후 TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 세포에서 분리된 RNA에서 cDNA 역전사입니다.- full-length K-bZIP cDNA를 CpoI 클로닝 부위를 사용하여 이중 발현 벡터로 전달합니다. 심폐소인수인척(CPI는 PCR 산물과 이중 발현 벡터의 1μg을 37°C에서 3시간 동안 분해합니다.
- 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동 후 분해된 DNA를 분리하고 추출합니다. 제조업체의 지침에 따라 16°C에서 30분 동안 T4 DNA 리가제로 인서트(K-bZIP) 및 벡터를 접합합니다(재료 표 참조).
- 1.5 mL 튜브에 50 μL 수용 대장균 세포 "A"(재료 표....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
선언된 이해 상충이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| pFastBac | 인비트로젠 | 제10359-016 | 이중 발현 baculovirus vector |
| pCR2.1-TOPO 벡터 | 인비트로젠 | PCR 산물 벡터 | |
| 수용 세포 E. coli DH5α | 이이스턴 바이오텍 | 파이678-80VL | 유능한 대장균 세포 A |
| 대장균 DH10Bac | 인비트로젠 | 제10359-016 | 유능한 대장균 세포 B |
| 푸게네HD | 로슈 | 4709705001 | Transfection 시약 |
| 옵티-MEM | 지브코 | 31985062 | 저혈청 배지 |
| T4 리가아제 | 뉴잉글랜드 바이오랩스 | M0202S | |
| CpoI(RsrII) | 써모 사이언티픽(Thermo Scientific | ER0741 | |
| 블루올 | 써모 사이언티픽(Thermo Scientific | 나1690 | 갈락토시다아제 기질 |
| 증권 시세 | 시그마-알드리치 | I6758-1G | |
| 그레이스의 곤충 매체 | 지브코 | 11605094 | |
| 소 태아 세럼 | 지브코 | 10082147 | |
| 겐타마이신 | 써모 피셔 | 15750060 | |
| 암피실린 | 시그마-알드리치 | A9393-25G | |
| 카나마이신 | 시그마-알드리치 | K0254-20ML | |
| 겐타마이신 | 지브코 | 제15710-064 | |
| 테트라사이클린 | 시그마-알드리치 | 87128-25지 | |
| LB 국물 | 머크 | 1.10285.0500 | |
| 헤페스 | 시그마-알드리치 | H4034-100지 | |
| 염화나트륨 | 시그마-알드리치 | S9888-5KG | |
| 케이클 | 머크 | 1.04936.1000 | |
| 나2HPO4 | 시그마-알드리치 | S5136-500G | |
| KH2사서함4 | J.T.베이커 | 3246-01 | |
| 나트륨 도데 실 설페이트 | 머크 | 1.13760.1000 | |
| β-메르캅토에탄올 | 바이오 라드 | Tel.: 161-0710 | |
| 트리스(기본) | J.T.베이커 | 4109-06 | |
| 무지방 우유 | 폰테라 | ||
| 글리세롤 | J.T.베이커 | 2136-01 | |
| 트리톤 X-100 | 암레스코 | 0694-1패 | 세제 A |
| 트윈 20 | 암레스코 | 0777-500ML | 세제 B |
| Poloxamer 188 용액 | 시그마-알드리치 | P5556-100ML | 세제 C |
| 프로테아제 억제제 칵테일 정제 | 로슈 | 전화 04 693 132 001 | |
| 3x 플래그 펩타이드 | 시그마 | F4799 | |
| anti-FLAG m2 마그네틱 비드 | 시그마-알드리치 | M8823 | 항체 태그가 붙은 마그네틱 비드 |
| SUMOlink SUMO-1 키트 | 액티브 모티프 | 40120 | 표준 SUMOylation 프로토콜 |
| SUMOlink SUMO-2/3 키트 | 액티브 모티프 | 40220 | 표준 SUMOylation 프로토콜 |
| QIAquick 젤 추출 키트 | 키아젠 | 28704 | |
| QIAGEN 플라스미드 미니 키트 | 키아젠 | 12123 | 플라스미드 추출 키트 |
| 폴리프로필렌 튜브 | 송골매 | 352059 | |
| 페트리 접시 | 송골매 | 351029 | |
| 세포 리프터 | 코 닝 | CNG3008 | |
| 로딩 팁 | 소렌슨 바이오사이언스 | 28480 | |
| 증권 시세 | 퍼킨엘머 | NEF1002 | |
| 여과지 취합 | 바이오 라드 | 1703932 | |
| 미니 슬래브 겔 장치 (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | 바이오 라드 | 1658001 에듀 | |
| Trans-Blot SD 반건조 전기영동 전사 셀 | 바이오 라드 | 1703940 | |
| 피어스 ECL 웨스턴 블로팅 | 열 | 32106 | ECL 시약 |
| 서스펜션 믹서 | Digisystem 실험실 기기 Inc. | SM-3000 | |
| 오비탈 셰이커 | 캔신 악기 (주) | 운영체제701 | |
| 이미지퀀트 LAS 4000 | GE 헬스케어 | 28955810 | |
| 생체 분자 이미저 | GE 헬스케어 | 28955810 | |
| SF9 | 써모 사이언티픽(Thermo Scientific | B82501 | |
| anti-p53 항체 | 세포 신호 전달 | #의 9282 | |
| 항토끼 항체 | GE 헬스케어 | NA934-1ML |
