형광 마이크로플레이트 기반 시클로헥시미드 추적 분석: 형광 핵 잘못 접힌 단백질의 분해 역학을 모니터링하는 기술

초록

출처: Guo, L. et. al., 세포에서 잘못 접힌 단백질의 분해에 대한 분석. J. Vis. 특급 (2016)

이 동영상은 형질주입된 포유류 세포의 핵에서 발현되는 형광 표지된 잘못 접힌 루시페라제 돌연변이 단백질의 분해 역학을 연구하기 위한 체외 형광 기반 마이크로플레이트 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 형광 돌연변이 단백질을 발현하는 세포를 번역 억제제와 프로테아좀 억제제로 처리하여 잘못 접힌 단백질의 프로테아좀 매개 분해를 평가하는 것을 포함합니다.

프로토콜

1. 시약의 준비

1. 마이크로플레이트 형광 리더를 사용하여 분석을 위한 저형광 DMEM 배지를 준비합니다. 25 mM 포도당, 0.4 mM 글리신, 0.4 mM 아르기닌, 0.2 mM 시스테인, 4.0 mM 글루타민, 0.2 mM 히스티딘, 0.8 mM 이소류신, 0.8 mM 류신, 0.8 mM 라이신, 0.2 mM 메티오닌, 0.4 mM 페닐알라닌, 0.4 mM 세린, 0.8 mM 트레오닌, 0.078 mM 트립토판, 0.4 mM 티로신, 0.8 mM 발린, 1.8 mM CaCl₂, 0.81 mM MgSO₄, 5.33 mM KCl, 44.0 mM NaHCO₃, 110 mM NaCl, 0.9 mM NaH₂PO₄. HCl 또는 NaOH를 사용하여 용액의 pH를 pH 7.4로 조정합니다. 여과를 통해 매체를 살균합니다.
   메모: 이 배지에는 Fe(NO₃)₃, 비타민 및 페놀 레드가 생략된 것을 제외하고는 포도당이 높은 표준 DMEM 배지의 성분이 포함되어 있습니다. 일반 DMEM 배양 배지의 페놀 레드(Phenol Red), 리보플라빈(riboflavin) 및 피리독살(pyridoxal)은 형광 신호의 검출을 크게 방해합니다. 이러한 성분이 없는 배양 배지는 성공적인 라이브 셀 GFP 이미징에 매우 중요합니다. 배지는 냉장 보관 시 12개월 동안 안정적입니다.

2. 형광 마이크로플레이트 리더를 이용한 NLS-luciferase-GFP의 실시간 분해 분석

1. 약 1 x 10⁴ HeLa 세포를 바닥이 투명한 검은색 96웰 조직 배양 플레이트에 파종합니다. O/N 배양 후, transfection.
   시 50-70%의 합류점에 도달합니다. 참고: 완전히 부유한 HeLa 세포를 포함하는 60μl의 배지를 각 웰에 직접 파종합니다. 파종 후 앞뒤로 추가 배지 또는 암판을 추가하지 마십시오, 그렇지 않으면 세포가 고르지 않게 분포될 수 있습니다.
2. 제조업체의 지침에 따라 transfection 시약을 사용하여 0.05-0.1 μg의 NLS-luciferase-GFP/pRK5 플라스미드가 포함된 HeLa 세포를 각 웰에 transfection합니다. DNA와 형질주입 시약을 포함하는 마스터 형질주입 혼합물을 만들고 각 웰에 대해 분취합니다. 세포가 있는 3개의 웰에는 DNA가 형질 주입되지 않으며, 이는 각 처리 조건에 대한 배경 형광 신호에 대한 제어 역할을 합니다.
   메모: transfection 변동을 줄이는 또 다른 방법은 seeding 전에 세포를 transfection하는 것입니다. 그러나 잘못 접힌 단백질로 형질주입된 세포의 상당 부분은 이 방법을 사용하여 부착되지 않거나 생존율이 감소합니다. 일부 세포는 독성이 잘못 접힌 단백질을 발현할 때 트립신 소화로 인한 스트레스를 견디지 못할 수 있습니다. 그 결과, 전체 형광 신호가 현저히 감소합니다.
3. transfection 후 20-24시간 후, excitation 파장 450-490 nm에서 GFP 발현을 위해 도립 형광 현미경으로 살아있는 세포를 검사합니다.
4. 진공 흡입으로 매체를 제거합니다. 각 웰에 약 200μl 1x PBS를 첨가한 다음 흡입하여 DMEM 배지의 잔류량을 제거합니다.
5. 60μl의 저형광 DMEM 배지와 5% FBS 및 50μg/ml CHX를 추가합니다. 프로테아좀 분해를 검사하려면 한 세트의 샘플에 추가 프로테아솜 억제제 MG132(10μM)를 포함시킵니다. 각 처리/조건에 대해 우물의 삼중을 설정합니다.
   메모: MG132 처리는 세포 사멸 및 형광 소멸을 포함하여 형광 신호의 감소를 유발할 수 있는 다른 요인을 배제하는 것이 중요하기 때문에 프로테아좀 분해에 대한 대조군으로 포함됩니다.
6. CHX.
   를 첨가한 후 형광판 리더에서 즉시 GFP의 형광 신호를 측정합니다. 메모: 소프트웨어 측정 설정은 표 1에 나와 있습니다.
7. 최대 8-10시간 동안 매시간 플레이트를 읽으십시오. 판독 후 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 다시 반환합니다.
8. 데이터를 스프레드시트 파일로 내보냅니다. 각 well에 대한 multi-read의 평균값과 형광 강도를 사용합니다. 각 데이터 포인트의 값을 각 그룹에서 Time 0의 평균값으로 정규화합니다. 시간 경과에 따른 정규화된 형광 강도를 그림 1A 및 1B와 그림 2, 오른쪽 패널에 표시된 것처럼 플롯합니다.
9. 반복 측정과 함께 양방향 ANOVA를 사용하여 두 조건 간의 성능 저하율에 대한 통계 분석을 수행합니다.
   메모: 이 분석에서 "형광 강도"는 종속 변수이고 "처리 조건"과 "시간"은 두 가지 요인입니다. 반복 측도를 사용한 양방향 분산 분석은 개별 시점의 데이터를 비교하는 대신 전체 시간 경과에 걸쳐 두 치료 그룹 간의 차이를 분석합니다.

표 1: 형광 마이크로플레이트 리더의 측정 설정.

개 년

플레이트 정의 파일		GRE96FB
측정 모드		형광 강도 바닥
파장	여기 파장	485 nm의
	여기 대역폭	9 nm의
	방출 파장	535 nm의
	방출 대역폭	20 nm의
플래시 횟수		5
게인		수동 200
통합 시간		20 μs
웰당 다중 판독	형	원(채워짐)
	크기	5×5
	국경	400 마이크로미터

결과

그림 1: NLS-LucDM-GFP 분해를 위한 형광 마이크로플레이트 기반 분석. 96개의 웰 플레이트에 파종된 HeLa 세포를 0.05μg(A) 또는 0.1μg(B) NLS-LucDM-GFP로 형질주입하고 MG132의 유무에 관계없이 CHX로 처리했습니다. (A와 B) 웰의 형광 강도는 표시된 시점(표준 편차± 평균값, n = 3)에서 측정되었습니다. 왼쪽의 패널은 원래의 형광 판독값을 보여주고, 오른쪽의 패널은 각 처리 그룹에서 Time 0의 판독값으로 정규화된 값을 보여줍니다. MG132를 투여한 그룹과 투여하지 않은 그룹 간의 차이는 반복 측정을 통한 양방향 ANOVA로 분석했습니다. 두 처리...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
둘베코의 변형된 독수리 매체	생명 기술	11995-092
소 태아 세럼	생명 기술	10082147
리포펙타민 2000	생명 기술	11668019
MG132	시그마-알드리치	M8699
아미노산	시그마-알드리치		아미노산은 낮은 형광 배양 매체를 만드는데 사용됩니다
시클로헥시미드	시그마-알드리치	C7698
Olympus IX-81 도립 형광 현미경	올림푸스	IX71/IX81
96웰 블랙 TC 플레이트(반투명 투명 바닥 포함	시그마-그라이너	89135-048
형광 바닥판 리더 Infinite 200® PRO	테칸	인피니트 200® 프로
프리즘 5	그래프패드		통계 분석 소프트웨어