세포 기반 AAV 중화 항체 분석: 혈청 내 특정 아데노 관련 바이러스에 대한 중화 항체를 검출하는 비색 기법

초록

출처: Bass-Stringer, S., et al. 비색 세포 기반 분석을 사용하여 AAV에 대한 중화 항체를 검출하는 단계별 방법. J. Vis. 특급. (2021년)

이 비디오에서는 양 혈청 샘플에서 알칼리 인산가수분해효소 발현 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청형 6(rAAV6) 벡터에 대한 중화 항체의 존재를 검출하는 체외 비색 분석을 시연합니다. 이 분석은 인간 태반 알칼리성 인산가수분해효소 유전자를 암호화하는 AAV와 그 기질 사이의 반응을 활용하여 불용성 보라색 생성물을 생성합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

분석 프로토콜의 개략적인 개요는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 초기 준비

1. 양 평가: 8mL 혈청 분리기 응고 활성화 튜브에 혈액을 채취하고(재료 표 참조) 혈액 샘플을 실온(RT)에서 20-30분 동안 그대로 둔 다음 2,100 x g에서 15분 동안 스핀다운합니다. 튜브 상단에 형성되는 투명한 상등액은 혈청입니다. 투명 수성상을 마이크로 원심분리기 튜브에 부분 표본으로 넣고 -80°C에서 보관합니다.
   메모: -80 °C의 혈청은 ~5년 동안 안정적으로 유지됩니다. 의식이 있는 동물의 16G 바늘(팁 컷오프)과 주사기를 사용하여 경동맥에서 혈액을 채취했습니다.
2. 비활성화된 소 태아 혈청(FBS)을 56°C의 수조에 30분 동안 넣고 간헐적으로 소용돌이쳐 가열합니다. 정밀도를 위해 동일한 양의 물이 들어 있는 두 번째 병에 온도계를 넣고 FBS 병과 동시에 열 수조에 추가합니다. 온도계가 56°C에 도달하면 타이밍을 시작하십시오.
3. 세포 배양 후드에서 수행되는 모든 후속 단계에 대해 적절한 무균 기술과 세포 배양 방법을 사용합니다. 사용하기 전에 모든 물체와 후드에 70% 에탄올을 뿌리고 완료 시 1% 차아염소산나트륨으로 청소하십시오.
4. 고포도당(4.5g/L) DMEM(89%)과 열 불활성화 FBS(10%) 및 페니실린 스트렙토마이신(1%)을 결합하여 완전한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)을 만드십시오. 멸균 진공 여과 시스템(0.22μm 공극 크기, 폴리에테르설폰 멤브레인)을 사용하여 결합 및 여과합니다(재료 표 참조). 전체 DMEM을 호일로 싸서 4°C에서 보관하십시오.
5. HT1080 세포(재료 표 참조)를 설정하고 75cm² 정사각형 플라스크에 통로를 만듭니다. 여러 개의 고정된 셀 스톡을 만듭니다. 20회 계대 후에 세포를 사용하지 마십시오. 추가 계대 배양은 분석 결과에 영향을 미칠 수 있습니다.

2. 1일차 - 세포 도금

1. HT1080 세포가 ~80% 포화도에 도달했을 때 계대를 형성합니다.
2. 수조에서 완전 DMEM(1.4단계에서 준비), 0.05% 트립신-EDTA 및 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 37°C로 예열합니다. 흡인 시스템을 사용하여 계파된 세포에서 성장 배지를 제거합니다.
   메모: 이 프로토콜의 모든 흡인은 멸균 5mL 혈청학 피펫에 튜브가 부착된 진공 시스템을 사용합니다.
3. 10mL의 예열된(37°C) 1x PBS로 세포를 세척하고 4mL의 예열된 0.05% 트립신-EDTA에서 3-4분 동안 세포를 트립신화하여 플라스크에서 세포를 분리합니다.
4. 6mL의 예열된 완전 DMEM을 첨가하여 트립신을 비활성화하고 세포를 50mL 튜브에 피펫팅합니다. 혈구계(hemocymeter)와 트리판 블루 배제법(trypan blue exclusion method)을 사용하여 생존 가능한 세포의 수와 농도를 계산합니다.
5. 예열된 완전 DMEM에서 세포를 1 x 10⁵ cells/mL의 농도로 희석합니다. 100μL의 세포/웰을 투명한 96웰 평평한 바닥 플레이트(웰당 1 x 10,⁴개 셀)에 시딩합니다. 플레이트를 37 ° C, 5 % 이산화탄소 (CO₂)에서 16-22 시간 동안 밤새 배양합니다.

3. 2일차 - 세포 감염

1. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 광학 현미경을 사용하여 세포가 웰 내에 고르게 분산되어 있고 포화도가 ~50%인지 확인합니다. 세포가 45%-55% 포화도 범위 내에 있지 않은 경우 'Day 1' 프로토콜을 반복하고 그에 따라 초기 세포 농도를 조정합니다.
2. 예열된 완전한 DMEM을 희석제로 사용하여 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 관심 혈청 샘플의 연속 희석을 생성합니다. 표 1은 3배 샘플에 대한 희석 캐스케이드(dilution cascade)의 생성을 보여줍니다.
   1. 분석을 3회 수행하려면 바이러스 원액을 1x PBS로 희석하여 AAV6-hPLAP의 7.5 x10⁶ 벡터 게놈(vg)/μL(재료 표 참조)을 준비합니다.
   2. 264μL의 혈청/매체 희석(총 부피/희석 330μL, 표 1 참조)을 포함하는 각 튜브에 7.5 x 10⁶ vg/μL 바이러스 작업 용액 66 μL를 추가합니다
      메모: 이는 완벽한 배양 조건을 필요로 하지 않는 강력한 분석법입니다. 그러나 각 분석 실행의 신뢰성을 정확하게 정량화하고 보장하려면 (1) 바이러스 및 배지 단독 대조군, (2) 배지 단독 대조군 및 (3) 동일한 실험 조건 하의 모든 플레이트에 NAb 양성 대조군 샘플을 포함해야 합니다. 설명된 부피(330μL)는 혈청과 바이러스 혼합물의 3배 샘플+10%를 차지합니다. 중화 활성의 정확한 측정을 위해 반복 복제를 수행하는 것이 좋습니다.
3. 피펫팅으로 바이러스/혈청 희석액을 혼합하고 바이러스/혈청 혼합물이 들어 있는 튜브를 37°C, 5% CO₂의 인큐베이터에 30분 동안 넣어 잠재적인 중화가 발생할 수 있도록 합니다.
4. 각 희석액에 대해 1 x 10⁴ cells/well을 포함하는 96웰 플레이트의 각 웰에 바이러스/혈청 혼합물 100μL를 피펫으로
   메모: 이것은 각 웰에서 15k 바이러스/세포 감염 다중성(MOI)의 최종 바이러스 농도를 생성합니다. 표 2는 샘플을 1/512 희석으로 평가하기 위한 96웰 샘플 플레이트 레이아웃의 예를 제공합니다.
5. 세포, 혈청 및 AAV-hPLAP이 포함된 96웰 플레이트를 호일로 싸서 AAV가 세포로 들어갈 수 있도록 37°C, 5% CO₂에서 하룻밤 동안 16-24시간 동안 인큐베이터에 넣습니다.

4. 3일차 - 세포에 기질 고정 및 추가

1. 1x PBS의 부분 표본을 37°C(~25mL/96웰 플레이트)로 예열합니다. PBS(~25 mL/96-well plate)와 이중 증류된 H₂O(DDW, ~25 mL/96-well plate)의 별도 부분 표본을 4 °C로 냉각합니다. 볼텍싱(vortexing)을 통해 50 mL 코니컬 원심분리 튜브에 10 mL의 DDW에 BCIP/NBT 펠릿(재료 표 참조)을 용해합니다(2 x 96 well plates에 10 mL이면 충분).
2. 96웰 플레이트의 웰에서 혈청학적 피펫 또는 흡입 기반 흡인 시스템 또는 흄 후드 진공 청소기에 부착된 유사한 것을 사용하여 배지를 흡입합니다. 혈청학적 피펫의 끝을 웰에 부드럽게 넣고 부착된 세포를 방해하지 않도록 주의하면서 배지를 제거합니다.
   1. 피펫을 사용하여 각 웰에 50μL의 RT 4% PFA를 추가합니다. 플레이트를 호일로 싸서 셀을 고정하기 위해 10분 동안 RT로 둡니다.
      주의: 파라포름알데히드(PFA)는 발암 가능성이 있는 물질이며 피부나 눈의 접촉 또는 흡입 시 독성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비와 안면 마스크와 함께 배기 후드를 다루십시오. PBS에 희석된 신선한 4% PFA를 만듭니다(96웰 플레이트당 ~7mL 필요).
3. 200μL의 RT 1x PBS로 세포를 세척하고 흡인합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.
   메모: 멀티채널 피펫은 피펫팅 단계를 위한 효율적인 옵션입니다.
4. 예열된 PBS 200μL를 각 웰에 피펫팅하고 플레이트를 호일로 싸서 65°C에서 90분 동안 배양하여 내인성 알칼리성 인산가수분해효소 활성을 변성시킵니다.
5. 웰을 흡입하고 200μL의 냉(4°C) PBS로 셀을 세척합니다. 다시 흡입하고 200μl의 차가운 DDW로 세척한 후 다시 흡입합니다.
6. 용해된 BCIP/NBT(단계 4.1에서 준비)를 각 웰에 50μL씩 피펫팅합니다.
7. 플레이트를 호일로 감싸고 RT에서 2-24 h.
   동안 배양합니다. 메모: 실행 사이의 잠복 시간을 일관되게 유지하십시오. 시간 유연성을 통해 사용자는 3일차 또는 다음 날에 유정 사진을 촬영할 수 있습니다.
8. 광학 현미경 카메라를 사용하여 4x 대물 렌즈를 사용하여 각 웰의 사진을 촬영하고 수행된 모든 분석에 대해 동일한 노출, 화이트 밸런싱 및 광 설정이 일관되게 사용되도록 합니다.
   1. 각 웰을 동일하게 배치하고 웰의 가장자리가 사진에 보이지 않도록 합니다. TIF 형식 또는 이와 유사한 형식으로 사진을 저장합니다.
      메모: 특정 설정은 현미경마다 다르지만 배경 조명이 높고 웰 전체에 걸쳐 일관된 경우 정량 분석이 가장 효과적입니다(그림 1B).

표 1: 혈청의 연속 희석액을 3배로 생성하는 데 필요한 혈청 및 희석제의 양.

초 년 년 년 년 년 년 월 년

희석 캐스케이드 라벨	희석	3 x 샘플(240 μL) + 10% 버퍼 용량(24 μL)	혈청의 비율 : 미디어
희석 1 (D1)	1/2	264μL 혈청 264μL 배지	50:50h
희석 2 (D2)	1/4	264μL D1 + 264μL 매체	25분 75
희석 3 (D3)	1/8	264μL D2 +264μL 매체	12.5:87.5
희석 4 (D4)	1/16	264μL D3 +264μL 매체	6.25분 93초 75
희석 5 (D5)	1/32	264μL D4 +264μL 매체	3.13:96.87
희석 6 (D6)	1/64	264μL D5 +264μL 매체	1.56:98.44
희석 7 (D7)	1/128	264μL D5 +264μL 매체	0.78:99.22
희석 8 (D8)	1/256	264μL D5 +264μL 매체	0.39:99.61
희석 9 (D9)	1/512	264μL D7 + 264μL 매체	0.2:99.8
희석 10 (D10)	2048년 1	132μL D8 + 396μL 매체	0.05:99.95
희석 11 (D11)	1/8192	132μL D9 + 396μL 매체	0.01:99.99
희석 12(D12)	1/32768	132μL D10 + 396μL 미디어	0.003:99.997

표 2: 1/2에서 1/512 범위의 희석액으로 naive 혈청 샘플을 평가하기 위한 예시 96웰 플레이트 레이아웃. AAV NAbs(투여 후 샘플)에 대해 양성인 것으로 알려진 샘플을 평가하거나 더 높은 역가가 필요한 경우 더 높은 희석이 분석에 통합됩니다. MO (-C): 미디어 전용 컨트롤입니다. VO(+C): 바이러스 및 미디어 전용 제어. mAb: AAV에 대한 단클론 항체(NAb 양성 대조군).

년 년 년 년 년 년 년 년 년

혈청 샘플 #1

혈청 샘플 #2

혈청 샘플 #3

Mono AB(mAB), 컨트롤 및 추가 샘플

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

50 ng MAb

50 ng MAb

50 ng MAb

B

1 / 4

1 / 4

1 / 4

1 / 4

1 / 4

1 / 4

1 / 4

1 / 4

1 / 4

5 ng MAb

5 ng MAb

5 ng MAb

C

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

0.5 ng MAb

0.5 ng MAb

0.5 ng MAb

D

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

MO (-C)

MO (-C)

MO (-C)

E

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

VO(+C)

VO(+C)

VO(+C)

F

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

샘플 #1 1/512

샘플 #1 1/512

샘플 #1 1/512

G

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

샘플 #2 1/512

샘플 #2 1/512

샘플 #2 1/512

H

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

샘플 #3 1/512

샘플 #3 1/512

샘플 >#3 1/512

결과

그림 1: NAb 분석 프로토콜의 개략도. (A) 3일 프로토콜과 관련된 주요 단계를 보여주는 NAb 분석의 시각적 표현. 간단히 말해서, 세포는 하룻밤 사이에 성장하고 도금됩니다. 다음 날, 혈청의 연속 희석액을 준비하고 AAV로 배양한 다음 밤새 세포와 함께 배양합니다. 다음 날, 세포를 고정하고, 세척하고, 배양하고, 기질과 결합하고, 다시 배양한 후 이미징 및 정량 분석을 수행합니다. (B) 최소 신호 제어(완전한 AAV 억제), 최대 신호 제어(억제 없음) 및 ~50% 신호 억제가 있는 양 혈청 샘플의 대표 이미지. 축척 막대 = 0.5mm.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.05% 트립신/EDTA	지브코	제25300-054
50 mL 코니컬 원심분리기 튜브	송골매	번호 14-432-22	또는 이에 상응하는
75cm사각 플라스크 2개	송골매	353136	또는 이에 상응하는
96 웰 평평한 바닥 플레이트	송골매	353072
AAV6-CMV-hPLAP 벡터			Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP은 요청 시 제공될 수 있습니다.
알루미늄 호일
항-AAV6 (온전한 입자) 마우스 단클론 항체, (ADK6)	프로젠	610159	양성 대조군 단클론 항체
비씨피/NBT	시그마패스트	B5655
세포 및 조직 배양 안전 캐비닛
전동 피펫			5 및 10 mL 스트라이프 인서트
소 태아 세럼	지브코	제10099-141
혈구계(Haemocytometer
고혈당 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)	지브코	11965118
HT1080 셀	증권 시세
부 화기			37 °C, 5% 이산화탄소2
카메라가 있는 광학 현미경			4x 대물렌즈로 사진 촬영 가능
오븐			65°C 배양용
파라포름알데히드	머 크	30525-89-4
수조
페니실린 스트렙토마이신	지브코	15140-122