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1. 성장 배지, ofloxacin 용액 및 E. coli 세포 스톡의 제조
- 일반 Luria-Bertani(LB) 배지: 탈이온수(DI)에 트립톤 10g/L, 염화나트륨(NaCl) 10g/L, 효모 추출물 5g/L를 추가합니다. 고압증기멸균으로 매체를 살균합니다.
- LB 한천 플레이트: DI 워터에 트립톤 10g/L, NaCl 10g/L, 효모 추출물 5g/L, 한천 15g/L를 첨가하고 고압증기멸균으로 배지를 살균합니다. 원하는 온도(~55°C)에서 ~30mL의 한천 배지를 정사각형 플레이트(10 x 10cm)에 붓습니다. 플레이트를 건조시키고 4 °C에서 보관하십시오.
- 변형된 LB 배지: DI 워터에 트립톤 10g/L와 효모 추출물 5g/L를 추가합니다. 고압증기멸균으로 매체를 살균합니다.
- 삼투압을 포함한 변형 LB 배지: 2x 변형 LB 배지와 2x 삼투압 용액을 동일한 부피로 혼합합니다. 2x 변형된 LB 배지를 준비하려면 DI 워터에 트립톤 20g/L와 효모 추출물 10g/L를 넣고 고압증기멸균으로 멸균합니다. 2x 삼투압 용액을 준비하려면 관심 삼투압(2x 양)을 DI water에 용해시킨 다음 용액을 여과 살균합니다.
메모: 관심 삼투압 및 그 농도는 Phenotype Microarray 스크리닝 분석에서 측정할 수 있습니다(프로토콜 4 참조). 그러나 테스트된 삼투압 및 관련 2배 농도는 연구의 성격에 따라 조정될 수 있습니다. 예를 들어, 1mM 염화나트륨의 영향을 연구하기 위해 2x 삼투압 용액은 2mM 염화나트륨 용액이 됩니다.
- 오플록사신 원액(5mg/mL): DI 물 1mL에 오플록사신(OFX) 염 5mg을 첨가합니다. 10μL의 10M 수산화나트륨을 첨가하여 물에 대한 OFX의 용해도를 높인 다음 용액을 여과하여 살균합니다. 부분 표본을 준비하고 -20 °C에서 보관하십시오.
메모: 오플록사신(Ofloxacin)은 성장중인 박테리아 세포와 성장하지 않는 박테리아 세포 모두에 널리 사용되는 퀴놀론 항생제입니다14,21. 대장균 MG1655 세포에 대한 OFX의 최소 억제 농도(MIC)는 0.039–0.078 μg/mL 범위 내에 있습니다. 또한 암피실린(ampicillin) 및 카나마이신(kanamycin)과 같은 다른 항생제도 지속생존 연구에 일반적으로 사용됩니다. 항생제의 선택은 연구의 성격에 따라 다릅니다.
- E. coli MG1655 cell stocks: 14mL 시험관(snap-capped)에 2mL의 regular LB 배지에 단일 콜로니를 접종하고 250rpm 및 37°C의 오비탈 쉐이커에서 세포를 배양합니다. 세포가 고정상에 도달하면 극저온 바이알에 500μL의 세포 배양액과 500μL의 50% 글리세롤(멸균)을 혼합하고 -80°C에서 보관합니다.
2. 기존 지속자를 제거하기 위한 세포 증식
- 하룻밤 배양을 준비하려면 멸균 피펫 팁으로 동결된 세포 스톡에서 소량의 세포를 긁어내고(글리세롤 세포 스톡을 해동하지 마십시오) 14mL 스냅 캡 테스트 튜브에 2mL의 변형된 LB 배지에 세포를 접종합니다. 오비탈 쉐이커에서 250rpm 및 37°C에서 12시간 동안 세포를 배양합니다.
- 첫 번째 전파
- 12시간 후, 250μL의 야간 배양을 멸균 알루미늄 호일로 덮인 250mL 배플 플라스크에 담긴 25mL의 새로운 변형 LB 배지로 옮깁니다.
- 세포가 중간 지수 단계(OD600 = 0.5)에 도달할 때까지 250rpm 및 37°C의 오비탈 셰이커에서 세포 배양을 성장시킵니다.
- 30분마다 마이크로플레이트 리더를 사용하여 600nm(OD600)에서 광학 밀도를 측정합니다.
- 두 번째 전파
- OD600 = 0.5에서 첫 번째 플라스크에서 250μL의 세포 배양액을 250mL의 배플 플라스크에 25mL의 새로운 변형 LB 배지로 희석합니다.
- 오비탈 쉐이커에서 250rpm 및 37°C에서 OD600=0.5가 될 때까지 두 번째 세포 배양을 성장시킵니다.
- 30분마다 광학 밀도를 측정합니다.
메모: 하룻밤 배양에는 상당한 양의 지속세포가 있을 수 있습니다. 상기한 희석/성장 주기 방법은 세포를 마이크로어레이로 이동시키기 전에 이러한 기존 지속인자를 제거하는 데 사용할 수 있습니다. 이들의 제거는 프로토콜 3에 설명된 분석을 통해 하룻밤 배양의 지속성 수준을 정량화하여 검증할 수 있습니다.
3. 기존 persister cell 제거 유효성 검사
- 두 번째 증식(단계 2.3 참조) 후 250mL의 배플 플라스크에서 25mL의 새로운 변형 LB 배지에 250μL의 세포 배양액(OD600 = 0.5)을 희석합니다.
메모: 대조군의 경우, 250mL의 배플 플라스크에 25mL의 새로운 변형 LB 배지에 250μL의 야간 배양(2.1단계 참조)을 희석합니다. 세포를 플라스크로 옮기기 전에 하룻밤 배양의 세포 밀도를 OD600 = 0.5를 얻기 위해 새로 변형된 LB 배지에서 조정해야 합니다.
- 25μL의 OFX 원액(5mg/mL)을 세포 현탁액에 추가하고 플라스크를 부드럽게 흔들어 분석 배양을 균일하게 만듭니다. 분석 배양에서 OFX의 최종 농도는 5μg/mL입니다.
- 250 rpm 및 37 °C의 오비탈 쉐이커에서 분석 배양을 배양합니다.
- 처리 중 매시간마다(OFX를 분석 배양물에 추가하기 전의 시점인 0시간 포함) 플라스크에서 1mL의 분석 배양을 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 마이크로 원심분리기 튜브에서 17,000 x g에서 3분 동안 분석 배양을 원심분리합니다.
- 세포 펠릿을 방해하지 않고 950 μL의 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
- 950μL의 인산염 완충 식염수(PBS) 용액을 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다.
- 항생제 농도가 최소 억제 농도(MIC) 미만이 될 때까지 세척 단계 3.5-3.7을 총 3회 반복합니다.
- 최종 세척 후 세포 펠릿을 100μL의 PBS 용액에 재현탁시켜 10배 농축된 샘플을 생성합니다.
- 10μL의 세포 현탁액을 취하고 96웰 원형 바닥 플레이트를 사용하여 90μL의 PBS 용액에 6회 연속 희석합니다.
- 10μL의 희석된 세포 현탁액을 항생제가 없는 신선한 한천 플레이트에 찾아냅니다. 검출 한계를 늘리려면 나머지 90μL의 세포 현탁액을 새 한천 플레이트에 플레이트합니다.
- 한천 플레이트를 37 ° C에서 16 시간 동안 배양 한 다음 집락 형성 단위 (CFU)를 계산합니다. 1mL의 분석 배양에서 총 CFU 수를 계산하는 동안 희석 속도를 고려합니다. 사멸 곡선은 항생제 치료 기간에 대한 로그 CFU 값을 플로팅하여 생성됩니다.
메모: 6시간 OFX 처리는 대장균 세포에 대한 이위상 사멸 곡선을 얻기에 충분합니다. 증식된 세포의 지속성 수준(6시간에서 CFU 계수로 측정)은 야간 배양보다 현저히 낮아야 합니다. 프로토콜 2 및 3에 설명된 절차는 연구 설계에 따라 일반 LB로 수행할 수 있습니다.
4. 마이크로어레이 플레이트 스크리닝
- 마이크로어레이 세포 배양 준비
- 50 mL 원심분리 튜브에서 250 μL의 지하급(exponential-phase) 세포를 25 mL의 새로운 변형 LB 배지로 옮깁니다. 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하여 균질하게 만듭니다.
메모: 지수 위상 셀(OD600 = 0.5)은 두 번째 전파 단계에서 얻습니다(2.3 단계 참조).
- 희석된 세포 현탁액을 멸균 50mL 저장소로 옮깁니다.
- 멀티채널 피펫을 사용하여 150μL의 세포 현탁액을 마이크로어레이의 각 웰, 즉 다양한 삼투압을 포함하는 96웰 플레이트로 전달합니다.
메모: 삼투압이 없는 우물은 제어 역할을 합니다.
- 마이크로어레이를 가스 투과성 밀봉 멤브레인으로 덮습니다.
- 37 °C 및 250 rpm의 오비탈 셰이커에서 24 시간 동안 플레이트를 배양
메모: 이러한 실험에서는 다양한 농도의 건조 상태에서 광범위한 삼투압, pH 완충액 및 기타 화학 물질을 포함하는 표현형 마이크로어레이(PM-9 및 PM-10)와 같은 상업적으로 이용 가능한 플레이트를 사용했습니다. 이러한 마이크로어레이는 절반 면적 96웰 플레이트 형식입니다. 배양 부피는 사용하는 플레이트의 유형에 따라 조정해야 합니다. 마이크로어레이는 수동으로 생성할 수도 있습니다.
- 마이크로어레이 플레이트의 수동 준비
- 75μL의 2x 삼투압 용액을 절반 면적 96웰 플레이트의 웰로 옮깁니다.
- 500 mL 원심분리 튜브에서 500 μL의 지하급(exponential-phase) 세포를 25 mL의 2x modified LB medium으로 옮깁니다. 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하여 균질하게 만듭니다.
메모: 접종률은 4.1에 기술된 마이크로어레이 스크리닝 프로토콜과 일치하도록 조정하였다.
- 2x 삼투압 용액을 포함하는 절반 면적 96웰 플레이트의 각 웰에 75μL의 세포 현탁액을 추가합니다.
- 37°C 및 250rpm의 오비탈 셰이커에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.
- 지속성분 분석 플레이트 준비
- 50mL 원심분리 튜브에 5μg/mL의 OFX를 함유한 25mL의 변형된 LB 배지를 준비하고 이 배지를 멸균 저장소로 옮깁니다.
- 멀티채널 피펫을 사용하여 OFX가 포함된 190μL의 변형된 LB 배지를 저장소에서 일반 평면 바닥 96웰 플레이트(지속성 분석 플레이트)의 각 웰로 이동합니다.
- 셰이커에서 마이크로어레이를 제거하고(24시간 배양 후) 마이크로어레이에서 10μL의 세포 배양액을 OFX로 변형된 LB 배지를 포함하는 지속형 분석 플레이트의 웰로 옮깁니다.
- persister-assay 플레이트에서 10μL의 세포 현탁액을 취하고 둥근 바닥 96웰 플레이트와 멀티채널 피펫을 사용하여 290μL의 PBS 용액에 3회 연속 희석합니다.
- 연속 희석 후 멀티채널 피펫을 사용하여 항생제가 없는 신선한 한천 플레이트에서 연속으로 희석된 모든 세포 현탁액 10μL를 찾아냅니다.
- 가스 투과성 밀봉 멤브레인으로 플레이트를 덮은 후 37°C 및 250rpm의 오비탈 셰이커에서 6시간 동안 persister-assay 플레이트(단계 4.3.3에서 준비)
를 배양합니다.
- 셰이커에서 6시간 배양 후 지속제 분석 플레이트를 꺼내고 4.3.4-4.3.5 단계를 반복합니다.
- 한천 플레이트를 37 ° C에서 16 시간 동안 배양 한 다음 CFU를 계산합니다. 항생제 처리 전과 6시간 후의 CFU 수치를 통해 각 웰의 지속분 분율을 계산할 수 있습니다. OFX 치료 전 CFU 계수는 삼투압의 영향과 대장균 생존력에 대한 영향을 평가하는 데도 도움이 됩니다.