1. 폴리글루타민 발현 동물을 이용한 근육 조직의 단백질 단백 분해 감소 측정
참고: 근육 세포의 단백질 단백 감소를 확인하기 위해 두 가지 방법을 사용할 수 있습니다: 노화 중 단백질 응집체의 형성을 이미징하는 방법(1.1)과 마비가 시작될 때까지 이러한 응집체가 노화에 따라 유발하는 단백질 독성을 측정하는 방법(1.2).
- 노화 중 근육의 폴리글루타민 응집체 형성 이미징
메모: 근육 세포에서 단백질 응집의 연령에 따른 진행은 노란색 형광 단백질(YFP)에 융합된 폴리글루타민(polyQ) 반복을 사용하여 이미지화됩니다. 이 프로토콜은 AM140 rmIs132[unc-54p::Q35::YFP] 균주의 사용을 설명하지만 다른 폴리글루타민 변이체 균주도 사용할 수 있습니다. polyQ::YFP 전이유전자는 unc-54 근육 특이적 프로모터를 사용하여 근육에서 발현됩니다. 동기화된 unc-54p::p olyQ::YFP 발현 동물은 성체 1, 2, 3, 4일에 시각화됩니다. unc-54p::p olyQ::YFP 응집체를 시각화하려면 형광용 복합 현미경 또는 형광 해부 현미경을 사용하십시오. AM140은 Caenorhabditis Genetics Center(CGC)에서 구할 수 있습니다 https://cgc.umn.edu/strain/AM140.
- 이미징 데이(성체가 된 1일, 2일, 3일, 4일)에 20마리의 동물을 선택하여 3% 아가로스 패드와 10mM 아지드화나트륨(M9 완충액에서 희석) 5μL 방울이 있는 현미경 슬라이드 설정에 장착합니다.
- 모든 동물을 아지드화나트륨으로 고정시킨 후(~5분) 10배 확대 렌즈를 사용하여 동물의 전신을 이미지화합니다(그림 1A). 이미징을 위해 FITC 필터를 사용하고 모든 동물에 대해 동일한 노출을 사용합니다. 이미징 후 슬라이드 폐기.
메모: 또는 YFP 병소를 플레이트에서 직접 정량화할 수도 있지만, 점수를 매기는 동안 플레이트에 이산화탄소 흐름을 적용하여 움직임을 억제해야 합니다. 이 대체 방법은 많은 수의 질환을 선별할 때 가장 적합합니다.
- 이미지를 획득한 후 전체 동물의 체벽 근육에 있는 병소의 수를 계산합니다. 초점은 배경의 더 어두운 용해성 신호와 구별할 수 있는 더 밝은 단점 신호입니다.
- 1일, 2일, 3일, 4일째부터 YFP 병소 축적의 진행 상황을 그래프로 표시합니다. XY 그래프를 그리는데, 여기서 X는 성인이 된 날을 나타내고 Y는 unc-54p::p olyQ::YFP foci의 수를 나타냅니다(그림 1B). 실험 조건(예: 유전자 하향 조절 또는 과발현)의 병소 수를 대조 동물과 비교합니다. 각 시도에 대해 관찰된 각 시점에서 그룹 간의 통계 분석을 수행합니다.
- 두 조건에 대해서만 초점 카운트를 비교하는 경우 각 시점에서 독립적인 표본 t-검정을 수행합니다.
- 세 개 이상의 조건에 대한 초점 수를 비교할 때 해당 시점의 모든 조건에 대한 데이터를 포함하여 각 시점에 대해 옴니버스 단방향 분산 분석 분석을 수행합니다. 옴니버스 분산 분석이 유의한 p-값(즉, p < 0.005)을 산출하는 경우, 쌍별 독립 표본 t-검정을 사용한 사후 분석을 수행하여 병소에서 유의한 차이가 감지된 특정 조건을 확인합니다(예: 그룹 A, B 및 C의 경우 A & B, A & C 및 B & C 비교).
2. 근육 세포의 폴리 글루타민 독성에 대한 대리 동물로 동물 마비 속도 측정
참고: 근육에서 polyQ 응집체의 연령에 따른 증가는 운동을 주도하는 근육 기능의 저하를 유발합니다. 이러한 운동의 결함은 polyQ-발현 동물에서 마비의 점진적 속도를 측정하여 결정할 수 있습니다. 마비 분석을 위해 동기화된 unc-54p::p olyQ::YFP 발현 동물은 성체 3일, 5일, 7일 및 9일에 점수가 매겨집니다. 필요에 따라 추가 시간 포인트를 추가하여 유전적 섭동의 영향을 평가할 수 있도록 점수 범위를 확장합니다.
- 점수를 매기는 날(성체가 된 3일, 5일, 7일, 9일)에 50마리의 동물이 들어 있는 6cm 접시를 보고 마비된 동물의 수를 기록합니다. 접시에서 마비된 동물을 꺼냅니다. 동물이 접시에서 기어 나오거나 죽었다면 검열을 받아야 합니다. 분석에서 설명할 수 있도록 이벤트를 기록합니다.
메모: 동물은 빛이나 부드러운 촉감 자극에 노출된 후 움직임이 관찰되지 않을 때 마비된 것으로 간주됩니다. 인두 펌핑 활동은 움직이지 않는 동물이 살았는지 죽었는지 확인하는 데 사용됩니다.
- 실험이 완료되면 각 조건의 마비 속도를 계산합니다. 각 시점에서 마비된 동물의 비율을 해당 상태에 대해 관찰된 총 동물 수로 나누어 이 작업을 수행합니다. 시점당 조건별로 여러 플레이트를 관찰하는 경우(즉, 반복 플레이트), 각 반복에 대한 비율을 개별적으로 계산합니다.
- 마비 속도의 진행 상황을 XY 그래프(산점도)로 표시합니다. X는 성인이 되는 날을 나타내고 Y는 마비 속도를 나타냅니다. unc-54p::p olyQ::YFP 동물의 마비율을 대조군 동물과 비교한 것입니다(그림 1C). 그룹 간의 통계 분석을 수행합니다. 여러 임상시험의 경우, 임상시험을 독립적으로 치료합니다. Cox 비례 위험 회귀 분석 및 Wald 검정을 사용합니다. 생존 분석을 지원하는 대부분의 데이터 분석 도구는 Cox 모델링도 지원합니다.
- 데이터 변환: 각 조건에는 시간에 대한 열과 "이벤트"에 대한 열, 두 개의 열이 있어야 합니다. 관찰된 각 시점에서 마비된 각 동물에 대해 "0"이 있는 행을 추가하고 각 중도절단된 동물에 대해 "1"이 있는 행을 추가합니다. 총 행 수는 해당 조건에 대해 플레이트에서 시작하는 동물의 수와 같아야 합니다.
- Cox Proportional-Hazards 모델링을 수행한 후 통계 소프트웨어의 지침에 따라 Wald 테스트를 수행합니다. 일변량 모형은 일반적인 실험 설계에 적합합니다. 세 개 이상의 조건에 대해 모든 조건이 포함된 테스트가 유의한 결과(즉, p < 0.005)를 나타내는 경우 조건 간의 쌍별 테스트를 수행하여 조건의 특정 유의한 쌍을 확인할 수 있습니다.
메모: Cox 모델은 테스트 조건이 시간에 따라 이벤트의 확률을 비례적으로 조절한다는 가정에 의존합니다. 예를 들어, Cox 모델은 대부분의 동물이 1일째에 마비되는 상태와 대부분의 동물이 9일째에 마비되는 상태를 비교하는 데 적합하지 않다는 것을 의미합니다. Cox 모델의 확장 및 각 시점에서 마비된 비율을 비교하기 위한 다른 접근 방식은 비례 위험 가정이 성립하지 않는 경우에 사용할 수 있습니다.
