Bacterial Co-Incubation Assay: 단일 세포 수준에서 특이성 내 박테리아 경쟁을 시각화하기 위한 형광 현미경 기반 기술

초록

출처: Smith, S., et al., Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging. J. Vis. 특급 (2021).

이 동영상은 단세포 수준에서 박테리아 경쟁을 연구하는 형광 현미경 기반 방법을 보여줍니다. 이 방법은 박테리아 군집의 구조와 기능에 대한 통찰력을 제공합니다.

프로토콜

1. 코인 큐베이트 박테리아 균주

1. 단세포 박테리아 경쟁 분석을 위해 두 가지 박테리아 균주를 선택하십시오. 여기에서는 V. fischeri의 두 가지 균주, 즉 접촉 의존적 사멸 메커니즘인 염색체 II(T6SS2)1의 VI형 분비 시스템을 사용하여 표적 균주를 죽이는 것으로 알려진 표적 균주(ES11424)와 억제제 균주(MJ1125)가 사용됩니다.
2. 다양한 형광 단백질(예: GFP 또는 RFP)에 대한 유전자를 인코딩하는 안정적인 플라스미드로 균주를 변환하여 현미경에서 균주 유형을 시각적으로 구별할 수 있습니다. 여기서, 억제제 균주는 GFP 인코딩 플라스미드(pVSV102)로 태깅되고, 표적 균주는 dsRed 인코딩 플라스미드(pVSV208)로 태깅됩니다.
3. 두 균주에 대한 mid-log 배양으로 시작하여 모든 샘플에 대해 600nm(OD₆₀₀)에서 광학 밀도를 측정하고 기록합니다.
4. 배양물을 LBS 배지로 희석하여 각 샘플을 OD₆₀₀ = 1.0(V. fischeri의 경우 약 10⁹ CFU/mL에 해당)으로 정규화합니다.
5. 라벨링된 1.5mL 튜브에 정규화된 각 균주 30μL를 첨가하여 부피에 따라 두 경쟁 균주를 1:1 비율로 혼합합니다. 1-2 s.
   에 대한 혼합 변형 배양을 소용돌이치십시오. 메모: 어떤 경우에는 다른 비율로 공동 배양을 혼합하는 것이 적절할 수 있습니다. 예를 들어, 한 균주가 다른 균주보다 훨씬 빠르게 성장하는 경우, 경쟁을 관찰하기 위해 수치적 우위에서 느리게 성장하는 균주를 시작해야 할 수 있습니다. OD₆₀₀이 두 균주에 대해 유사한 CFU/mL에 해당하지 않는 경우에도 최적화가 필요할 수 있습니다.
6. 각 생물학적 복제 및 처리에 대해 1.5단계를 반복합니다. 여기에 표시된 예에서 이는 총 4개의 혼합 변형 튜브, 즉 야생형 억제제 균주와 표적 균주가 혼합된 2개의 생물학적 복제와 표적 균주와 혼합된 VI형 분비 시스템 돌연변이 균주가 포함된 2개의 생물학적 복제입니다.
7. 한천 패드의 동전 배양에서 접촉 의존적 사멸을 위해 경쟁 세포가 충분히 조밀하도록 하려면 표준 1.5mL 원심분리 튜브에서 혼합 배양액을 21,130 x g에서 1분 동안 원심분리하고 상등액을 버리고 각 펠릿을 20μL LBS 배지에 재현탁하여 각 혼합 배양을 3배 농축합니다. 각 샘플에 대해 반복합니다.
   메모: 일부 박테리아 세포는 높은 rcf에서 원심분리에 의한 손상에 민감합니다. 이러한 경우, 혼합 배양액을 4600 x g에서 3분 동안 원심분리할 수 있습니다. 또한 접촉 의존 경쟁을 정량화할 때 사멸을 관찰하기 위해 슬라이드에서 충분한 세포 밀도를 보장하는 것이 중요합니다. 이 논문에서 사멸이 관찰되는 "밀집된" 처리는 약 10개의 세포/20μm2를 가졌습니다.

2. 슬라이드 설정

1. 정립 현미경을 사용하는 경우 표준 5mm 유리 슬라이드에^{~2mm 1} 아가로스 패드를 놓습니다. 혼합 배양액 2 μL를 아가로스 패드에 반점하고 그 자리에 #1.5 커버슬립(25 mm²)을 놓습니다. 그림 1B를 참조하십시오.
2. 도립 현미경을 사용하는 경우 35mm 페트리 접시의 #1.5 커버슬립 바닥에 2μL의 혼합 배양물을 발견하고 동전 배양 지점 위에 ~5mm² 아가로스 패드를 놓습니다. 아가로스 패드 위에 12mm 원형 유리 커버슬립을 놓습니다. 예를 들어 그림 1C를 참조하십시오.
3. 나머지 3개의 혼합 배양에 대해 사용된 현미경 설정에 따라 2.1 또는 2.2 단계를 반복하여 4개의 슬라이드 또는 접시를 이미지화합니다.
4. 계속하기 전에 슬라이드를 약 5분 동안 벤치탑에 놓으십시오. 이를 통해 세포는 한천 패드에 정착하고 이미징 과정에서 움직임을 제거할 수 있습니다.

3. 형광 현미경 검사

1. 먼저 백색광(위상차 또는 DIC)을 사용하여 세포에 초점을 맞춰 광표백의 영향을 최소화합니다. 단일 박테리아 세포의 평균 크기를 기준으로 60x 또는 100x 오일 대물렌즈를 사용합니다.
2. 배경 감지를 최소화하면서 적절한 채널에서 셀이 보이도록 각 채널의 노출 시간 및 획득 설정을 조정합니다.
   메모: 채널마다 다른 노출 시간을 사용하는 것이 적절하지만, 주어진 채널에 대한 모든 생물학적 복제 및 처리에서 동일한 노출 시간을 사용해야 합니다.
3. 각 샘플에 대해 최소 5개의 시야(FOV)를 선택하고 획득 설정을 사용하여 각 적절한 채널에서 이미지를 획득합니다(그림 2의 예 참조). 최종 시점 동안 동일한 FOV를 이미지화할 수 있도록 각 FOV의 XY 점을 저장합니다. 분석 단계에서 표적 세포 또는 억제 세포가 차지하는 영역의 비율을 결정하기 위해서는 각 시점에서 동일한 FOV를 이미징하는 것이 필요합니다.
   메모: 이 예에서 GFP의 형광은 여기 파장이 467 - 498 nm이고 방출 필터가 513 - 556 nm인 필터를 사용하여 검출되며 거짓 녹색입니다. dsRed의 형광은 여기 파장이 542 - 582 nm인 필터와 603 - 678 nm의 방출 필터를 사용하여 검출되며 가색 자홍색입니다.
4. 2시간 후 이전에 저장된 XY 점을 사용하여 각 샘플에 대해 위의 단계를 반복합니다(그림 2).
   메모: 후속 이미지의 타이밍은 성장 속도나 경쟁 메커니즘이 다른 유기체에 맞게 최적화해야 할 수 있습니다.

결과

그림 1: 코인큐베이션 분석을 위한 아가로스 패드 준비 및 슬라이드 설정. (A) 2% 아가로스 패드를 만들기 위한 설정. 5겹의 실험실 테이프(녹색)가 약 20mm 떨어진 두 지점에서 커버 슬립을 감쌉니다. 다음으로, 해양 인산염 완충 식염수(노란색)에 담긴 따뜻한 2% 아가로스를 테이프 조각 사이에 피펫으로 넣고 즉시 25mm² 커버 슬립으로 덮고 실온에서 최소 1시간 동안 응고시킵니다. 면도날을 사용하여 아가로스 패드를 ~5mm²조각으로 자르고 핀셋을 사용하여 패드를 이미징을 위한 새 슬라이드로 옮깁니다. (B) 정립 현미경에서 이미징할 때 5mm² 아가로스 패드를 슬라이드에 직접 놓고 혼합 배양...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브	어부	전화: 05-408-129
10 uL 싱글채널 피펫
1000 uL 싱글채널 피펫
20 uL 싱글채널 피펫
200 uL 싱글채널 피펫
아가로스	어부	BP165-25	저융점 아가로스
Cellvis 35mm 접시	어부	NC0409658	#1.5 커버 유리 바닥
클로람페니콜	시그마	C0378	스톡 (에탄올 중 20 mg / mL); 매체 내 최종 농도 (2 μg / mL LBS)
FIJI 이미지 분석 소프트웨어	이미지J	https://imagej.net/Fiji/Downloads	오픈 소스 소프트웨어
Fisherbrand 커버 안경: 서클	어부	12-545-81피	#1.5 커버 유리; 12mm 직경
카나마이신 설페이트	어부	BP906-5	스톡(물 중 100mg/mL, 필터 멸균); 매체 내 최종 농도(1μg/mL lbs)
렌즈 청소 티슈 페이퍼	어부	S24530
페트리 플레이트	어부	FB0875713	뚜껑이 있는 멸균
면도날	어부	S65921
세미 마이크로 큐벳	폭스바겐	97000-586
분광 광도계
Thermo Scientific Gold Seal 일반 현미경 슬라이드	어부	12-518-100B
Thermo Scientific Richard-Allan Scientific 커버 글라스	어부	Tel.22-050-235	#1.5 커버 유리, 25mm2
F형 이멀젼 오일	어부	NC0297589
카메라 및 이미징 소프트웨어를 사용한 정립 또는 도립 형광 현미경			이 기사의 이미지는 NIS-Elements 소프트웨어를 사용하여 ORCA-Fusion Digital CMOS 카메라가 장착된 Nikon TI-2 도립 형광 현미경에서 획득했습니다.
소용돌이
수조			피펫팅 전에 아가로스를 따뜻하게 유지하는 데 사용됩니다.
LBS 미디어
1M 트리스 버퍼 (pH ~ 7.5)			50mL 1M 스톡 버퍼(62mL HCl, 938mL DI water, 121g Trizma 염기)
Agar 기술	어부	DF0812-17-9	15g (플레이트에만 추가)
탈이온수			950 밀리리터
소금	어부	시즌 640-3	20 지
트립톤	어부	BP97265	10 지
효모 추출물	어부	BP9727-2	5 지
mPBS(해양 PBS)			해양 소금이 첨가 된 인산염 완충 식염수; 아가로 스 패드를 만드는 데 사용됩니다
10X PBS	어부	ICN1960454
인스턴트 오션 바다 소금	인스턴트 오션	SS1-160피	적절한 염분으로 농도를 조정하십시오. 여기에 20psu가 사용됩니다.
멸균 진공 필터 장치	어부	SCGVU01RE	mPBS를 여과-멸균하는 데 사용됩니다.
진공 펌프			mPBS를 여과-멸균하는 데 사용됩니다.