Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay: 단백질-단백질 상호작용을 억제하는 소분자를 스크리닝하기 위한 비드 기반 근접 Assay입니다.

초록

출처: Wang, L. et al., Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay. J. Vis. 특급 (2021)

이 비디오에서는 증폭된 발광 근접 균질 분석(bead-based proximity assay)을 시연합니다. 이 제품은 균일한 크기의 수용체 및 공여체 비드를 사용하며, 단백질 상호 작용을 억제하는 잠재적인 소분자를 스크리닝하기 위해 상호 작용하는 경향이 있는 두 개의 단백질로 고정되어 있습니다.

프로토콜

참고: 이 프로토콜에 대한 개요는 그림 1에 나와 있습니다.

1. GST-FKBP51 및 GST-FKBP52의 발현 및 정제(그림 1A)

1. 플라스미드
   참고: IMAGE 컨소시엄에서 human FKBP51 (clone id: 5723416) 및 human FKBP52 (clone id: 7474554)에 대한 cDNA 클론을 획득합니다.
   1. BamHI 및 XhoI 돌출부를 포함하는 프라이머(정방향; 5'GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3', 역방향; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3')를 사용한 PCR로 human FKBP51 DNA를 증폭하고 BamHI/XhoI 제한 부위에서 pGEX6-1 벡터로 clone합니다.
   2. EcoRI 및 XhoI 돌출부를 포함하는 프라이머(정방향; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3', 역방향; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3')를 사용하여 human FKBP52 DNA를 증폭하고 EcoRI/XhoI 제한 사이트에서 pGEX6-2 벡터로 clone합니다.
      메모: PCR 반응 설정 및 조건은 표 1 및 표 2에 나타내었습니다.
   3. 삽입된 염기서열을 확인하고 제조 프로토콜에 따라 플라스미드를 화학적으로 적극적인 E. coli로 변환합니다.
2. 단백질 발현 및 정제
   1. 증류수 25L에 루리아 육수(LB) 베이스 1g을 넣어 LB 용액을 만듭니다. 121°C에서 15분 동안 오토클레이브합니다. 냉각 후 50μg/mL 암피실린을 첨가합니다.
   2. GST-FKBP51 또는 GST-FKBP52를 발현하는 박테리아 군체를 1.5mL 튜브에 500μL의 LB 용액과 혼합합니다. 소용돌이.
   3. 알루미늄 호일로 덮인 삼각 플라스크에 있는 LB 용액 1L에 "1.2.2"의 혼합물을 추가합니다. 삼각 플라스크를 37°C에서 밤새 셰이커에 배양합니다.
   4. 삼각 플라스크에 1mM 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하고 추가로 2시간 동안 배양을 계속합니다.
   5. 세포 펠릿을 얻으려면 5,000 x g에서 15분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다.
      메모: 셀 펠릿은 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.
   6. 세포 펠릿을 PBS 40mL에 재현탁시키고 얼음에서 3 x 20초 동안 초음파 처리합니다. 단백질 가수 분해를 방지하기 위해 1mM PMSF, 1mM EDTA 및 단백질 분해 효소 억제제 칵테일(1정)을 추가합니다.
   7. 현탁액을 50,000 x g으로 30분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거하고 5mL GST-트랩 컬럼에 상층액을 도포합니다.
   8. 30mL PBS로 컬럼을 세척한 후 PBS에 10mM 글루타티온 5mL로 GST-FKBP51 및 GST-FKBP52를 용리합니다.
   9. 15 mL 10.000 MWCO 원심분리 장치에 단백질을 농축합니다. 유리 글루타티온을 제거하려면 0.5x PBS와 평형을 이룬 PD-10 컬럼에 농축액을 통과시키고 다시 필터 원심분리기 장치에 농축합니다.
   10. 단백질 함유 분획을 수집합니다. SDS-PAGE에서 단백질을 확인하고 단백질 농도를 1mg/mL.
       로 조정합니다. 메모: 일반적인 단백질 수율은 2-5 mg/L 배양입니다. 단백질은 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.

2. Hsp90 C 말단 펩타이드와 수용체 비드의 커플링 (그림 1B)

1. Hsp90 펩타이드 제제
   1. 펩타이드 합성 서비스를 통해 인간 Hsp90 베타 이소폼(UniProt ID: P08238)의 아미노산 714-724에 해당하는 10개의 아미노산 펩타이드 NH 2-EDASRMEEVD-COOH를 합성합니다.
   2. PBS의 Hsp90 펩타이드를 1mg/mL 농도로 희석합니다.
2. 수용체 비드 준비
   1. PBS의 접합되지 않은 수용체 비드를 1mg/mL 농도로 희석하고 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
   2. 16,000 x g에서 15분 동안 원심분리로 세척을 수행합니다. 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
3. 활용
   1. 비드와 펩타이드 사이의 비율을 10:1로 설정합니다. 1mg의 수용체 비드 펠릿이 들어 있는 1.5mL 튜브(위에서 설명한 대로 준비)에 PBS(pH 7.4) 1mL, 희석된 펩타이드 0.1mg, Tween-20 1.25μL, 400mM 시아노보로수소화나트륨(NaBH_3CN) 용액 10μL를 물에 추가합니다.
      주의: NaBH₃CN은 독성이 있습니다. 흄 후드와 장갑을 사용하십시오. NaBH₃CN 용액은 새로 준비해야합니다.
   2. 회전식 셰이커에서 end-over-end 교반(10-20 rpm)으로 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.
4. 반응 담금질 및 구슬 세척
   1. 반응에 20μL의 1M Tris-HCl(pH 8.0) 용액을 첨가하여 미반응 부위를 차단합니다. 37 °C에서 1 시간 동안 배양합니다.
   2. 16,000 x g(또는 최대 속도)에서 4°C에서 15분 동안 원심분리기. 상등액을 제거하고 비드 펠릿을 1mL의 Tris-HCl 용액(100mM, pH 8.0)에 재현탁합니다.
   3. 세탁 단계를 세 번 반복합니다.
   4. 마지막 원심분리 후 비드를 보관 버퍼(0.01% 아지드화나트륨을 방부제로 사용한 0.5 × PBS 1mL)에 1mg/mL로 재현탁합니다. 공액 수용체 비드 용액을 4°C의 빛 보호
      주의: 아지드화나트륨은 독성이 있습니다. 흄 후드와 장갑을 사용하십시오.

3. GST-FKBP51 또는 GST-FKBP52와 Hsp90 C 말단 펩티드 사이의 상호 작용 및 저분자 질량 화합물과의 억제를 조사하는 분석법(그림 1C)

1. 글루타티온 공여체 비드와 상호 작용하는 GST 태그 단백질
   1. 384웰 플레이트에서 반응을 설정합니다.
   2. 0.5x PBS, pH 7.4.
      에 10μg/mL의 글루타티온 공여체 비드를 함유한 용액을 준비합니다. 메모: 장기간 보관하면 비드가 가라앉고 와류가 필요합니다.
   3. GST-FKBP51 또는 GST-FKBP52를 최종 농도 10μg/mL에 추가합니다.
   4. 25 ° C의 어둠 속에서 10 분 동안 배양하십시오 .
      메모: 이 단계에서 GST 태그가 지정된 단백질은 비드에 부착된 글루타티온과 상호 작용합니다. 각 웰에 대해 이 혼합물 22.5μL가 사용됩니다. 결합 파트너의 농도는 경험적으로 결정되어야 합니다. GST-FKBP51 및 GST-FKBP52를 적정하고 최상의 신호를 제공하는 농도를 선택합니다.
2. 화합물 첨가
   1. DMSO.
      에서 테스트 화합물을 연속 희석합니다. 메모: 사용되는 농도는 일반적으로 10, 30, 100, 300, 1,000 및 3,000μM입니다.
   2. 0.25μL의 DMSO(음성 대조군) 또는 Hsp90 C-말단 펩타이드(양성 대조군, 30μM) 또는 DMSO의 화합물을 플레이트의 각 웰 모서리에 추가합니다. 모든 화합물 농도에 대해 삼중을 사용합니다.
   3. GST 태그가 지정된 단백질이 있는 글루타티온 공여체 비드가 포함된 용액 22.5μL를 각 웰에 추가합니다.
   4. 접시를 손으로 부드럽지만 철저히 흔듭니다. 25 ° C의 어둠 속에서 15 분 동안 배양하십시오 .
      메모: 이 기간 동안 화합물은 Hsp90 C-말단 펩타이드 결합 부위에서 TPR 도메인과 상호 작용합니다.
3. 수용체 비드 추가
   1. Hsp90 C-말단 펩타이드가 부착된 수용체 비드를 0.5x PBS에서 100μg/mL로 희석합니다.
   2. 각 웰에 2.25μL의 희석된 수용체 비드를 추가합니다.
   3. 부드럽지만 철저하게 섞습니다. 25 ° C의 어둠 속에서 15 분 동안 배양하십시오 .
      메모: 이 단계에서 donor와 acceptor bead는 protein-peptide 상호 작용에 의해 근접하게 됩니다. 반응 혼합물의 최종 부피는 25μL입니다. 따라서 화합물의 최종 농도는 0.1 - 30μM 범위입니다.
4. 플레이트 판독
   메모: 해당 모드로 설정된 플레이트 리더를 사용하여 플레이트를 읽습니다.
   1. 기기를 켜고 소프트웨어를 엽니다.
   2. 관련 프로토콜을 선택합니다.
   3. Edit plate map(플레이트 맵 편집)을 클릭하고 측정을 위해 플레이트에서 사용 중인 웰을 선택합니다.
   4. 다음을 클릭하여 계속 진행하고 선택한 프로토콜을 실행합니다.
   5. 측정 후 결과 표시를 클릭하여 결과를 봅니다.
   6. 데이터를 내보냅니다.

표 1: human FKBP51 및 FKBP52 DNA 증폭을 위한 PCR 반응.

개 개 개 분

반응 성분	부피(μL)
PCR 완충액(농축액 5개)	4
포워드 프라이머	1
리버스 프라이머	1
플라스 미드	0.5
dNTP 믹스(각 10mM)	0.5
Phusion DNA 중합효소	0.5
물(DNA 등급)	12.5
합계	20

표 2: 인간 FKBP51 및 FKBP52 DNA 증폭을 위한 열원cyler 조건.

의 개 의 분 의 분 의 개

무대	온도(°C)	시간	사이클
초기 변성	94	3 분	1
변성	94	30초	35
어 닐 링	56	30초
확장	72	1
최종 확장	72	5 분	1
참고: 뚜껑 온도는 105 °C입니다.

결과

그림 1: 이 프로토콜의 회로도. (A) GST-FKBP51 및 GST-FKBP52의 발현 및 정제. (B) Hsp90 C 말단 펩타이드와 수용체 비드의 결합. (C) GST-FKBP51 또는 GST-FKBP52와 Hsp90 C 말단 펩타이드 간의 상호 작용을 조사하는 분석법. 작은 분자 질량 화합물을 가진 금지.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
384웰 플레이트	퍼킨 엘머	6008350	분석 용량 25ml
Amicon 10.000 MWCO 원심분리 장치	밀리포어	UFC901008	농축 단백질
암피실린	시그마	A0166	항생제
박테리아 셰이커 Unimax 1010	하이돌프		배양균
human FKBP51을 위한 cDNA 클론	출처: BioScience	클론 ID: 5723416	pCMV-SPORT6 벡터
human FKBP52를 위한 cDNA 클론	출처: BioScience	클론 ID: 7474554	pCMV-SPORT6 벡터
화학적으로 유능한 대장균	인비트로젠	C602003	원샷 BL21 스타(DE3)
디엠소	수펠코	1.02952.1000	묽은 화합물
디피에스	지브코	14190-144	솔루션 준비
에디타	칼바이오켐	344504	초음파 처리 중 단백질 분해 방지
글루타치온	시그마	G-4251	GST 태그가 붙은 단백질 용리
글루타티온 공여체 구슬	퍼킨 엘머	6765300	기증자 구슬
GST-트랩 컬럼	싸이티바(GE 헬스케어)	17528201	GST 태그가 붙은 단백질 정제
이소 프로필 -β-D-티오 갈락토 시드	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	R0392	단백질 발현 유도
LB 브로스(밀러)	시그마	L3522	미생물 성장 배지
PCR 기기	바이오 래드	S1000 써멀 사이클러	증폭/PCR
PD-10 컬럼	싸이티바(GE 헬스케어)	17085101	솔루션 교환
pGEX-6P-1 벡터	싸이티바(GE 헬스케어)	28954648	플라스 미드
pGEX-6P-2 벡터	싸이티바(GE 헬스케어)	28954650	플라스 미드
플레이트 리더	퍼킨 엘머	EnSpire 2300 멀티라벨 리더	알파 플레이트 읽기
플레이트 리더 소프트웨어	퍼킨 엘머	EnSpire 관리자	플레이트 리더 소프트웨어
플레이트 리더 소프트웨어 프로토콜	퍼킨 엘머	Alpha 384-well 저용량	이 프로토콜을 사용하여 플레이트를 읽습니다
증권 시세	시그마	P7626	초음파 처리 중 단백질 분해 방지
프로테아제 억제제 칵테일	시그마	S8830	초음파 처리 중 단백질 분해 방지
아지드화나트륨	시그마	시즌 2002	방부제로서
시아노보로수소화나트륨(NaBH3CN)	시그마	156159	커플링을 위한 매트릭스 활성화
인간 Hsp90 베타 동형의 아미노산 714-724에 해당하는 10개의 아미노산 펩티드 NH2-EDASRMEEVD-COOH	펩타이드 2.0 inc		Hsp90 C-말단 펩타이드 합성
시험관 회전자	라빈코		종단 간 교반을 하십시오
트리스 - HCl	시그마	10708976001	수용체 비드의 미반응 부위 차단
트윈-20	시그마	P1379	비드 응집 방지
울트라 원심분리기 Avanti J-20 XP	벡크만 쿨터		박테리아 세포 펠릿을 얻기 위한 원심분리기
초음파 세포 분뇨기	마이크로슨		단백질을 방출하기 위해 세포를 초음파 처리
Unconjugated acceptor beads (비접합 수용체 비드)	퍼킨 엘머	6762003	수락자 구슬
XCell SureLock 미니 셀 및 XCell II 블롯 모듈	인비트로젠	EI0002	SDS 페이지