바이러스 플라크 분석(Virus Plaque Assay): 바이러스에 감염된 세포의 단층에 형성된 플라크의 정량화를 통해 단순 포진 바이러스를 측정하는 기법

초록

출처: Sadowski, L. A. et al. 단순 포진 바이러스의 플라킹. J. Vis. 특급 (2021년)

이 비디오는 전염성 단순 헤르페스 바이러스 또는 HSV의 바이러스 플라크 분석에 대해 설명합니다. 희석된 바이러스 입자는 상피 세포의 단층에 접종됩니다. 배양 시 바이러스는 플라크를 형성하고 감염성 바이러스 역가를 결정하기 위해 육안으로 계수됩니다.

프로토콜

1. Vero 세포의 파종

1. 플라크 분석을 시작하기 전날, Vero 세포를 트립신화하고 일반 Dulbecco's Modified Eagles Medium(DMEM)에 재현탁하고 표준 세포 배양 방법론에 따라 보충합니다. confluent Vero 세포(~10,⁷개 세포)의 T-75 플라스크당 10mL의 DMEM에 트립신화된 세포를 재현탁합니다.
   참고: DMEM은 세포 성장 속도를 약간 늦추고 더 나은 플라크 분석 결과를 선호하기 때문에 알파-MEM 대신 플라크 분석에 사용됩니다.
2. 선호하는 방법(예: Trypan Blue 제외가 있는 표준 혈구계)으로 세포를 계수합니다.
3. 세포를 4 x 10⁶ cells/plate에 seed합니다. HSV-2의 경우 well당 2.5mL의 DMEM(보충제 포함)이 있는 6-well plate를 사용하고, HSV-1의 경우 well당 1.25mL의 DMEM(보충제 포함)이 있는 12-well plate를 사용합니다.
   참고: 세포의 수는 사용된 플레이트에 관계없이 일정해야 하지만, 웰의 크기는 플라크 분석의 정확도와 관련하여 중요합니다. 세포를 고르게 분포시키는 것이 필수적이며, 이는 플레이트를 원형이 아닌 앞뒤로 움직여 가장 효과적으로 달성할 수 있습니다.
4. 세포가 가습 인큐베이터에서 37 ° C / 5 % CO₂에서 밤새 자라도록합니다 .
   알림: 습도는 인큐베이터 바닥에 살조제가 들어있는 증류수 팬으로 유지됩니다.

2. 시료 희석

1. 한 번의 실험실 세션에서 샘플 희석과 세포에 바이러스 첨가를 완료합니다.
   주의: HSV-1 및 -2는 사람에게 전염성이 있으므로 적절한 생물 안전성 봉쇄(BSL-2) 하에 처리해야 합니다. 바이러스와 접촉하는 모든 물질을 분리하여 보관하고 생물 안전성 캐비닛에서 제거하기 전에 1/256 희석(재료 표 참조), 요오드포, 표백제 또는 강한 이온 세제(예: SDS)로 4차 제제로 소독하십시오.
2. Vero 세포를 파종한 다음 날, 1x PBS에 플라크를 칠할 각 바이러스 샘플을 연속적으로 희석합니다. 일반적으로 가장 정확한 추적을 위해 10배 희석액을 사용합니다.
3. ^10-4(저농도 바이러스의 경우) 또는 ^10-9(더 높은 역가 샘플이 예상되는 경우)를 통해 이러한 희석을 수행하며, 플라크 분석 자체를 위해 각 샘플이 1mL 이상 남아 있습니다.
4. 이러한 희석된 바이러스 샘플을 세포에 추가할 준비가 될 때까지 모든 바이러스 희석액을 얼음 위에 보관합니다(1시간 이내).

3. 세포에 바이러스 추가

1. 피펫으로 하나 또는 두 개의 웰에서 세포 배양 배지를 제거합니다.
   참고: 흡인기는 세포 단층에서 너무 많은 액체를 제거하고 세포를 건조시키므로 사용하지 마십시오. 한 가지 중요한 고려 사항은 실험의 전체 과정 동안 세포 단층이 수화 상태를 유지하도록 하는 것입니다. 세포가 건조되면 마지막 단계에서 플레이트를 씻어내고 사용할 수 없는 데이터를 생성합니다. 따라서 이러한 가능성을 줄이기 위해 한 번에 하나 또는 두 개의 우물만 처리하십시오.
2. 희석된 바이러스 샘플(6웰 및 12웰 플레이트에는 각각 100-400μL 및 50-200μL)을 각 단층에 적가하고 각 웰 측면의 아래쪽으로 방울을 추가합니다. 전체 플레이트가 플라크되는 바이러스 샘플로 채워질 때까지 하나 또는 두 개의 웰마다 이 과정을 반복합니다.
   참고: 웰 중앙에 방울을 추가하면 실수로 세포가 기질에서 벗겨질 수 있습니다.
3. 바이러스가 포함된 PBS가 각 웰에 있는 세포의 전체 단층을 덮도록 전체 플레이트를 손으로 부드럽게 흔든 다음 플레이트를 37°C의 CO₂ 인큐베이터에 넣어 바이러스가 흡착할 수 있도록 합니다.
4. 1시간 이내에 10분마다 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 다시 부드럽게 흔들어 각 웰에 바이러스를 더 고르게 퍼뜨린 다음 인큐베이터에 다시 넣습니다.
   참고: 각 실험은 반복 횟수와 사용되는 희석액을 결정합니다. 독자의 선호가 그 결정을 좌우합니다.
5. 흡수되지 않은 접종물을 실수로 계수할 가능성을 줄이려면 1000μL 피펫 팁으로 웰에서 바이러스 샘플을 제거하고 폐기물 비커에 넣습니다.
   참고: 다시 말하지만, 이 절차는 세포 단층의 수화를 유지하기 위해 한 번에 하나 또는 두 개의 웰로만 수행됩니다.
6. 메틸셀룰로오스 오버레이 2.5mL를 놓습니다(PBS 100mL에 5% 메틸셀룰로오스를 용해하고 액체 사이클에서 121°C 및 15psi에서 15분 동안 오토클레이브한 다음 DMEM 375mL와 FBS 25mL를 추가합니다).
7. 전체 플레이트에 오버레이가 포함되면 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣어 이틀 동안 자랄 수 있도록 합니다.
   참고: 바이러스와 세포가 3일 동안 성장하도록 내버려 두면 DMEM plus 보충제에서도 단층의 세포가 크게 손실되어 최종 데이터가 손상될 수 있습니다.
8. 생물 안전 캐비닛에서 제거하기 전에 일반적으로 표백제, 요오드 또는 이와 유사한 살균제를 첨가하여 폐기물 비커를 소독하십시오.

4. 플라크 염색

1. 2일간의 배양 후 피펫으로 메틸셀룰로오스 오버레이를 제거하고 한 번에 하나 또는 두 개의 웰을 다시 제거하고 폐기물 비커에 넣습니다.
2. 2% 에탄올에 1% 크리스탈 바이올(재료 표 참조) ~50mL를 각 웰에 첨가하여 플라크를 염색합니다.
   참고: 오버레이의 마지막 한 방울을 모두 제거할 필요는 없습니다.
3. 얼룩으로 채워진 모든 웰이 있는 플레이트를 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 이때 위와 같이 3.8단계에서 폐기물 비커를 소독합니다.
4. 유출수가 깨끗해질 때까지 수돗물로 접시를 세게 씻으십시오.
   참고: 잔잔한 물줄기는 충분히 활기차지 않습니다. 실험실 싱크대 고정 장치의 최대 압력이 필요합니다.
5. 이 시점에서 각 희석 시리즈에서 플라크 수에 약 10배의 차이가 있는지 확인합니다.
6. 접시를 밤새 거꾸로 건조시킨 후 개별 플라크를 계산할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
12웰 플레이트	코 닝	3512
6웰 플레이트	코 닝	3516
알파-MEM	론자	12169층
항생제/항진균제	지브코	15240096
크리스탈 바이올렛	알파 에자르	B2193214
DMEM을 참조하십시오.	지브코	11965092
둘베코의 PBS (Mg++ 또는 Ca++ 없음)	지브코	14190144
태아 송아지 세럼	밀리포어-시그마	TMS-013-B
L-알라닐-L-글루타민(글루타맥스)	지브코	GS07F161BA
혈구계	써모 피셔	02-671-54
메틸셀룰로오스	밀리포어-시그마	27-441-0
Quaternary 제제 (Lysol I.C.)	써모 피셔	NC9645698
트리판 블루	코 닝	25900CI
트립신	싸이티바	SH30042.01
베로 세포	증권 시세	CCL-81

년 년 호 표시기 시리즈