동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. TUNEL 분석
- 키트리디오진균증의 임상 징후를 보이는 동물과 동일한 수의 Bd 음성 대조군 동물을 안락사시킵니다.
- 각 동물의 피부(등쪽, 배쪽, 넓적다리) 샘플을 해부합니다. 4% v/v 인산염 완충 포름알데히드에서 2시간 동안 피부 샘플을 고정합니다. 짧고 일관된 고정 시간으로 조직을 완전히 고정할 수 있을 뿐만 아니라 효과적이고 정확한 면역조직화학 염색이 가능합니다. 그런 다음 절편을 위해 포매할 때까지 80% 에탄올로 옮깁니다.
- 표준 방법에 따라 조직학적 준비를 위해 파라핀 왁스에 피부를 삽입합니다. 간단히 말해서 프로토콜은 다음과 같습니다.
- 등급이 매겨진 일련의 에탄올로 조직을 탈수하고 자일렌으로 에탄올을 제거합니다. 조직을 파라핀 왁스에 삽입하고 각 개인에 대한 세 가지 피부 샘플을 모두 하나의 파라핀 블록에 넣습니다.
- 표준 조직학적 제제에 따라 마이크로톰을 사용하여 피부를 절편합니다. 조직을 5μm에서 연속적으로 절단한 다음 친수성 유리 슬라이드에 부착합니다. 슬라이드당 스킨 유형별로 4개의 연속 히스토절개를 배치합니다. 연속적인 피부 절편이 있는 개인당 3개의 슬라이드를 만들고, 각 슬라이드에는 각 조직의 4개의 절편이 부착되어 있음을 기억하십시오.
- 다음 순서로 슬라이드를 염색합니다.
- 첫 번째 슬라이드를 헤마톡실린으로 염색한 다음 에오신 대조염색(H&E)을 합니다. 이 슬라이드는 피부 내에서 Bd 포자낭의 위치를 시각화하기 위한 것입니다.
- 조직학적 준비를 위해 시중에서 판매되는 TUNEL 분석에 따라 두 번째 슬라이드를 염색하고 아래에 설명된 제조업체의 지침을 따릅니다.
- 먼저, 코플린 항아리의 조직 부분을 세척할 때마다 5분 동안 자일렌을 세 번 갈아서 슬라이드를 세척하고 세척할 때마다 5분 동안 100% 에탄올을 두 번 교체하여 파라핀을 제거합니다. 95% 에탄올을 3분 동안 한 번 씻은 다음 70% 에탄올을 3분 동안 씻습니다. PBS를 5분 동안 한 번 세탁하여 마무리합니다.
- 갓 희석된 단백질 소화 효소(PBS로 희석된 20μg/mL 농도의 단백질 분해 효소 K)로 조직을 전처리하고 슬라이드에 직접 첨가합니다. 15분 동안 배양합니다. 코플린 항아리에 PBS를 두 번 갈아서 각각 2분씩 씻습니다.
- 여분의 액체를 두드리고 코플린 용기에 PBS의 3.0% 과산화수소를 넣고 실온에서 2분 동안 담금질합니다. PBS로 두 번 헹구고 각 세척마다 5분 동안 헹굽니다.
- 여분의 액체를 두드려 제거한 다음 75 μL/5 cm2의 평형 완충액을 슬라이드의 조직에 직접 적용합니다. 10초 동안 배양합니다. 섹션 주변의 여분의 액체를 두드리고 55 μL/5 cm2의 작동 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT) 효소를 적용합니다. 가습 챔버에서 37 °C에서 1 시간 동안 배양합니다.
- TdT 배양 후 슬라이드를 작업 강도 정지/세척 버퍼의 코플린 병에 넣고 15초 동안 교반한 다음 실온에서 10분 동안 배양합니다. PBS를 세 번 갈아타서 슬라이드를 세탁할 때마다 1분 동안 세탁합니다. 여분의 액체를 두드리십시오.
- 실온으로 데워진 항 디곡시제닌 접합체(로다민)를 65 μL/5 cm2 조직에 도포합니다. 가습 챔버에서 실온에서 30분 동안 배양하고 빛에 노출되지 않도록 하십시오. PBS를 4번 갈아타서 세탁할 때마다 2분씩 세탁합니다. 여분의 액체를 두드리십시오.
- 카운터 염색 역할을 하는 슬라이드 장착 매체에 0.5 - 1 μg/mL DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 15 μL를 추가하여 마무리합니다. 그런 다음 커버 슬립으로 덮고 매니큐어나 고무 시멘트로 밀봉합니다. 분석법이 빛에 민감하므로 슬라이드를 어두운 곳에서 건조시키십시오.
- TUNEL 분석 및 DAPI 카운터스테인을 사용하여 세 번째 슬라이드를 염색하되 각 샘플에 대한 양성 및 음성 대조군으로 사용합니다.
참고: 대조군 슬라이드의 4개 히스토절편 중 처음 2개는 양성 대조군 반복이고 마지막 2개는 음성 대조군 반복입니다.
- 양성 대조군의 경우 1.5.2.2단계 대신 DN 완충액(30mM 트리즈마 염기, pH 7.2, 4mM MgCl2, 0.1mM DDT)으로 조직을 전처리하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 최종 농도 0.1ug/mL의 DN 버퍼에 Dnase I을 용해하고 슬라이드에 직접 적용합니다. 실온에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 dH2O를 5회 세척하여 3분 동안 슬라이드를 세척합니다. 과도한 액체를 닦아내십시오. 그런 다음 섹션 1.5.2.3의 지시에 따라 TUNEL 분석을 다시 시작합니다.
- 음성 대조군의 경우, 해당 샘플에 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT) 효소를 추가하지 마십시오(섹션 1.5.2.4 참조).
2. 분석이 완료되는 즉시 TUNEL 슬라이드를 관찰합니다.
- 형광 현미경을 사용하여 각 피부 절편을 따라 200X 간격으로 무작위 간격으로 사진을 촬영하며, 세포사멸 세포를 드러내고 빨간색으로 나타나는 로다민 염색과 모든 핵을 드러내고 파란색으로 나타나는 DAPI에 대한 필터를 사용하여 세포 오버레이를 생성할 수 있습니다. 샘플당 피부 절편당 최소 100개의 세포가 촬영되었는지 확인합니다. 슬라이드를 -20°C의 어두운 현미경 상자에 보관하십시오.
- 이미지당 세포(파란색 DAPI 염색)를 계산합니다. 피부 절편당 최소 100개의 세포가 계수되도록 합니다. 100개의 셀에 도달하려면 이미지 내의 모든 셀을 계산합니다. 한 이미지에 100개 미만의 세포가 있는 경우 동물당 피부 절편당 최소 100개의 세포에 도달할 때까지 다른 이미지를 계산합니다.
- 다음으로, 동일한 이미지에서 TUNEL 양성 세포의 수를 계산합니다(빨간색 로다민 염색). 괴사나 배경이 아닌 세포사멸을 나타내는 TUNEL-positive cell은 투명한 세포 가장자리를 가진 단일 세포입니다(membranes는 lysis 없이 손상되지 않음). 때때로 세포는 수축하여 자가사멸체(apoptotic body)를 형성합니다.
- TUNEL 분석에서 계수된 면적을 찾고 H&E 염색 히스토절편에서 해당 영역을 분석합니다. H&E 염색 절편이 Bd 감염 부위와 일치하는지 확인하고, TUNEL 분석에서 세포사멸 세포를 계수할 때 Bd 감염 부위가 사용되는지 확인합니다.
