Caspase-3/7 Assay: 개구리 피부 이식에서 Caspase-3/7 활성을 측정하여 세포사멸을 정량화하는 발광 기반 분석

초록

출처: Brannelly, L. A. et al., Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling(TUNEL) 및 Caspase 3/7 Assay를 사용하여 키트리디오진균증이 있는 개구리의 표피 세포 사멸 측정.J. Vis. 특급 (2018).

이 동영상은 세포 사멸 또는 세포사멸을 정량화하기 위한 체외 Caspase-3/7 발광 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 pro-luminescent DEVD 기질의 caspase-3/7 절단 후 생성된 발광을 측정합니다. 생성된 발광은 caspase-3/7 활성에 비례합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 축산 및 모니터링

1. 동물을 개별적으로 수용하고, 종에 적합한 환경에서, 적절한 물, 먹이 주기 및 청소 일정을 갖출 수 있습니다. 매일 동물을 확인하십시오.
   1. 포획 사육 시설에서 기증된 멸종 위기에 처한 Litoria verreauxii alpina(Caspase 3/7 분석, 섹션 4의 경우)의 성체 개체를 사용하십시오. 동물을 15 - 18 °C에서 이끼와 자갈 기질로 유지하고, 매일 역삼투압수로 분무하고, 내장이 가득 찬 귀뚜라미를 일주일에 3번 먹입니다.
2. 매주 한 번씩 각 개인에 대한 데이터를 수집합니다. 2.1단계에서 설명한 대로 Bd에 대한 개인을 면봉으로 채취합니다. 저울을 사용하여 각 동물의 무게를 0.1g에 가깝게 측정하고 다이얼 캘리퍼를 사용하여 SVL(snout to vent) 길이를 0.01mm 단위로 측정합니다.
3. 접종 후(섹션 3에 설명된 대로) 동물 윤리 지침에 따라 감염의 임상 징후(불규칙한 피부가 벗겨지거나, 식욕 부진, 다리가 빨갛게 변하거나, 무기력증 또는 지연된 교정 반사)가 있는지 매일 동물을 확인합니다. 임상 징후와 이환율이 있는 경우 동물을 안락사시킵니다.
   1. 트리카인 메탄설포네이트(MS222)를 과다 투여하여 안락사시킵니다(0.1% w/v MS222에서 pH 6 - 7, 숙성된 수돗물에서 중탄산나트륨). 동물을 모든 동작이 멈추고 자극에 반응하지 않은 후 10분 동안 MS222에 두십시오.

2. Bd 감염 검사

1. Bd 면봉
   1. 새로운 멸균 레이온 면봉(동물당 면봉 1개)으로 각 동물을 면봉으로 닦습니다. 다음 면봉 방법을 사용하십시오: 인공호흡기에 5회, 허벅지, 옆구리, 팔다리에 각각 5회. 이것은 총 45 스트로크입니다.
   2. DNA를 효과적으로 포착할 수 있도록 스트로크 중과 스트로크 사이에 면봉을 부드럽게 회전시킵니다. 면봉 팁을 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브로 분리하고 추출할 때까지 -20°C에서 보관합니다.
2. DNA 추출 및 qPCR 분석
   1. 30 - 40 mg의 0.5 mm 실리카 비드와 함께 시판되는 DNA 추출 시약 50 μL를 첨가하여 면봉에서 게놈 DNA를 추출합니다. 비드 비터 세포 교란기에서 샘플을 최대 속도로 2분 동안 비드 비트합니다. 비드 비터 단계에 따라 2,000 x g에서 1분 동안 샘플을 원심분리합니다.
   2. 샘플을 100°C에서 10분 동안 배양하고 식힙니다. 5,000 x g에서 3분 동안 샘플을 원심분리한 다음 상등액을 개별 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 -20°C에서 qPCR까지 보관합니다.
   3. Boyle et al. 2004에 따른 정량적 PCR(qPCR)을 사용하여 감염 부하를 분석합니다. 다음 수정 사항을 사용합니다.
      1. DNA 추출 샘플을 이중 탈이온수로 6:100 희석합니다. PCR 억제를 방지하기 위해 각 웰에 0.7μL의 소 혈청 알부민(BSA)을 추가합니다. 각 샘플을 singlicate로 실행합니다. 각 플레이트에서 일련의 희석 표준과 함께 음성(템플릿 없음) 대조군과 양성 대조군을 사용하여 동물원포자(감염) 부하를 추정합니다.

3. 접종

1. 문화 Bd
   1. 탈이온수 16L에 트립톤 16g, 젤라틴 가수분해물 2g, 유당(TGHL) 4g을 첨가하여 배양 육수를 준비합니다. 오토클레이브(121°C에서 40분)하고 육수를 식힙니다.
   2. TGHL 배지에 Bd 분리 (이 경우, 뉴 사우스 웨일즈 분리, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, 통로 번호 11에서 분리)를 접종하고 23 ° C에서 7 일 동안 성장 한 다음 배지 배양을 TGHL 한천 플레이트로 옮깁니다.
   3. 플레이트를 만들려면 트립톤 16g, 젤라틴 가수분해물 2g, 유당(TGHL) 4g, 세균 한천 10g을 탈이온수 1L와 오토클레이브(121°C에서 40분 동안)에 추가합니다. 혼합물이 만질 수 있을 만큼 충분히 식었지만 응고되기 전에 TGHL 한천을 92mm 직경의 배양 플레이트에 붓고 Class II 생물 안전 캐비닛에서 1/4에서 1/3이 가득 찼습니다.
   4. 한천이 응고되고 완전히 냉각되면 액체 육수에서 0.5mL의 Bd를 각 플레이트에 접종하고 고르게 펴 바릅니다. Bd 육수 혼합물을 플레이트에서 약 1시간 동안 건조시킨 다음 플라스틱 파라핀 필름으로 플레이트를 밀봉합니다. 플레이트를 23 ° C에서 5-7 일 동안 한천을 아래로 향하게하여 배양합니다.
2. zoospore 접종 용액을 위한 플러드 플레이트
   1. 접종 전에 매일 생존 가능성을 확인하기 위해 도립 광 현미경으로 zoospore 운동성을 확인하십시오. 동물원 포자 방출이 많고 많은 동물원 포자가 포자낭 밖에서 수영하면 배양은 접종할 준비가 된 것입니다.
   플레이트에
   2. 물을 붓고 실온에서 10분 동안 배양하여 동물원 포자가 물 속으로 방출될 수 있도록 각 플레이트에 숙성된 수돗물 또는 인공 연못 물을 3mL 붓습니다. 잠복기가 끝나면 zoospore 현탁액을 새 멸균 용기에 디캔팅합니다.
   3. 혈구계를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 동물원 포자 농도를 추정합니다. zoospore 현탁액의 농도가 알려지면 숙성된 수돗물로 현탁액을 3mL당^{1 x 10 6} zoospore의 농도로 희석합니다.
3. 동물에게 접종합니다
   1. 각 동물에게 접종 혼합물 3mL를 개별 50mL 용기에 담긴 벤터에 부어 접종합니다. 과도한 접종물이 접종 용기의 바닥으로 모이도록 합니다. 감염을 확인하기 위해 각 동물을 개별 접종 용기에 24 시간 동안 남겨 두고, 24 시간 접종 후에는 각 동물을 소독 된 테라리움으로 되돌려 놓습니다.
      1. 13% 부피/부피(v/v) 상업용 표백제 용액을 사용하여 terraria를 소독하고 물로 두 번 이상 헹군 다음 24시간 이상 건조시킵니다.
   2. Bd 음성 대조군의 경우, 3.2 - 3.3과 동일한 방법을 사용하여 동물을 모의 접종하되 Bd가 없는 한천 플레이트에 Bd가 접종된 한천 플레이트 대신 5mL의 숙성된 수돗물을 주입합니다.

4. 카스파제 3/7 분석

1. 접종 후 3주차까지 매주 한 번, 실험이 끝날 때까지 격주로 개체당 최대 8개의 발가락을 각 동물(Bd- 노출 및 Bd- 음성 모두)의 발가락 끝을 수집합니다.
   1. 화염 멸균 가위로 두 번째 지골의 발가락 끝을 자르고 1.5mL 마이크로튜브에 넣고 즉시 -80°C에서 동결합니다.
2. 얼어붙은 발가락 샘플에서 단백질을 추출합니다.
   1. 1.5mL 나사 캡 마이크로튜브에 두 개의 스테인리스강 비드(3.2mm)와 함께 100μL의 샘플 버퍼(25mM HEPES pH 7, 5mM MgCl₂)에 샘플을 넣습니다. 최대 속도(1.2.1단계에서 사용된 것과 동일한 비드 비터에서)로 1분 비드 박동을 4회 반복한 다음 얼음에서 3분 동안 샘플을 용해합니다. 용해 후 12,000 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리 시료를 추출합니다. 분석에 사용할 상등액을 수집합니다.
3. Bradford assay를 사용하여 샘플당 단백질 농도를 정량화합니다.
   1. 384웰 플레이트에 단백질 추출물 10μL와 Bradford 시약 10μL를 혼합하고 실온에서 2분 동안 배양합니다. 일련의 5배 BSA 희석 표준물질과 함께 각 시료를 복제하여 수행합니다. 흡광도 플레이트 리더에서 595nm에서 흡광도를 읽습니다.
4. 또는 발가락 끝 샘플이 너무 작은 경우(단백질 농도가 Bradford 분석에서 결정된 최저 표준에 가깝거나 샘플링된 개구리의 총 중량이 3g 미만인 경우) Bradford 분석 대신 사진을 사용하여 피부 표면적을 추정하여 샘플을 표준화합니다.
   1. caspase 분석을 위해 샘플에서 단백질을 추출하기 전에 도립 광 현미경을 사용하여 각 발가락을 40X 배율로 촬영합니다.
   2. 컴퓨터 이미징 소프트웨어를 사용하여 발가락 면적을 추정하여 발가락 샘플을 분석합니다. 발가락 클립의 가장자리 주위에 선을 그리고 이미징 소프트웨어가 모양 내의 면적을 추정하도록 하여 이 작업을 수행합니다. 그런 다음 해당 영역에 파이(3.14)를 곱하면 3차원 피부 샘플의 표면적에 근사치가 됩니다(길이 x 단면적(파이 x 직경)이 튜브의 외부 표면적을 제공함).
5. caspase 3/7 assay를 수행합니다.
   1. 384웰 발광 플레이트에 시판되는 caspase 3/7 시약 10μL와 단백질 추출물 10μL를 추가합니다. 각 샘플을 세 번에 걸쳐 실행합니다.
   2. 플레이트를 15초 동안 천천히 흔들어 시약을 혼합합니다. 실온에서 30분 동안 플레이트를 빛으로부터 멀리 배양합니다. 발광판 판독기를 사용하여 발광을 측정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
폴라스타 오메가	BMG 랩텍		발광판 리더
384 웰 플랫 클리어 바닥판	코 닝	3707
384 웰 낮은 플랜지 흰색 평면 바닥 플레이트	코 닝	3570
한천 세균학(옥소이드)	어부	OXLP0011B
유당 육수(옥소이드)	어부	OXCM0137B
중탄산나트륨	어부	BP328-500
트리케인-S (MS-222)	어부	NC0872873
트립톤	어부	BP1421-500
소 세럼 알부민	인비트로젠	15561020
멸균 레이온 면봉	의료 와이어 및 장비	MW-113
Coomassie Bradford 시약	뚫다	23200
카스파제 글로 3/7	프로메가	G8090
HEPES 버퍼	시그마-알드리치	H0887-20ML
염화마그네슘	시그마-알드리치	1374248-1지
젤라틴 가수분해물 효소	시그마-알드리치	G0262
PBS(인산염 완충 식염수), pH 7.2(1X)	Thermo/Life (써모/라이프	Tel.: 20-012-043
프레프만	Thermo/Life (써모/라이프	4318930
TaqMan 패스트 어드밴스드 마스터 믹스	써모피셔	4444556
클로록스 표백제	클로록스
에탄올, 200 proof, 분자 등급	어부	BP2818500
ZEISS Axio Scan 형광 현미경	칼 자이스		형광 현미경
3.2mm 스테인레스 스틸 비드	바이오스펙	11079132SS
프라이머 ITSI-3 Chytr (5'-CCTTGAT ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3')	타크만		프라이머 및 프로브를 위한 개별 설계
프라이머 5.8S Chytr (5'-TCGGTT CTCTAGGCAACAGTTT-3')	타크만		프라이머 및 프로브를 위한 개별 설계
마이너 그루브 바인더 프로브 Chytr MGB2(5'-CGAGTCGAAC-3')	타크만		프라이머 및 프로브를 위한 개별 설계
Rotor-Gene qPCR 기기	키아겐		qPCR 기계
마이크로 원심분리기 튜브 1.5ml	어부	전화: 02-681-372
세포 배양 페트리 플레이트	눕크	263991
미니 비드비터 지르코니아-실리케이트 비드, 0.5mm	바이오스펙	11079105Z

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