Phagocytosis Assay: Drosophila melanogaster의 배아 세포에서 세포사멸 세포 삼킴을 시각화하는 면역염색 기술

초록

출처: Nonaka, S. et al. 초파리 배아의 세포사멸 세포에 대한 식세포 분석. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 Drosophila melanogaster의 균질화된 배아 세포에서 세포사멸 세포 삼킴을 시각화하는 면역염색 기술을 보여줍니다. 이 방법은 자가사멸 세포 삼킴의 정도를 결정하여 세포 생리학에 대한 통찰력을 제공합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 혈구의 염색

1. anti-Croquemort 항체를 이용한 면역염색
   1. 유리 슬라이드를 메탄올에 10분 동안, 0.2%(v/v) Triton X-100을 함유한 PBS에서 10분 동안 연속적으로 담근 다음 PBS에서 10분 동안 담궈냅니다.
   2. 차단을 위해 세포에 0.2%(v/v) Triton X-100을 함유한 PBS에 5%(v/v) 전체 돼지 혈청 20μL를 장착합니다. 슬라이드를 실온에서 20분 동안 배양합니다.
   3. 유리 슬라이드에서 용액을 제거하고 0.2%(v/v) Triton X-100을 함유한 PBS에 20μL의 anti-Croquemort antiserum(0.1% (v/v))을 세포에 장착합니다. 슬라이드를 4°C에서 밤새 배양합니다.
   4. 0.2%(v/v) Triton X-100이 함유된 PBS에 유리 슬라이드를 10분 동안 5회 담급니다.
   5. 유리 슬라이드를 PBS에 10분 동안 담급니다.
   6. 0.2%(v/v) Triton X-100 및 5%(v/v) 통돼지 혈청을 함유한 PBS에 20μL의 알칼리성 인산가수분해효소 표지 항쥐 IgG(0.5%(v/v))를 실온에서 1시간 동안 세포에 장착합니다.
   7. 0.2%(v/v) Triton X-100이 함유된 PBS에 유리 슬라이드를 10분 동안 5회 담급니다.
   8. 100mM Tris-HCl, pH 9.5, 100mM NaCl 및 50mM MgCl2가 포함된 완충액에 유리 슬라이드를 10분 동안 담그십시오.
   9. 세포에 0.23mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate(BCIP), 0.35mg/mL 니트로 블루 테트라졸륨(NBT), 100mM Tris-HCl, pH 9.5, 100mM NaCl 및 50mM MgCl₂를 포함하는 인산가수분해효소 기질 용액을 장착합니다.
   10. 적절한 염색을 위해 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 혈구의 과립에 강한 보라색 신호가 나타나면 기질 용액을 제거하고 10mM Tris-HCl, pH 8.5 및 1mM EDTA로 구성된 완충액에 유리 슬라이드를 담그십시오. 약 5 - 10분 동안 염색하는 것이 좋습니다.

2. TUNEL의 염색 세포사멸 세포

1. 유리 슬라이드를 PBS에 5분 동안 담가둡니다.
2. 새 PBS로 반복합니다.
3. 평형 버퍼(재료 표 참조)를 10분 동안 셀에 장착합니다.
4. 유리 슬라이드에서 용액을 제거하고 5μL의 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소와 15μL의 반응 완충액을 포함하는 20μL의 TdT 용액을 37°C의 세포에 1시간 동안 장착합니다.
5. 유리 슬라이드에서 용액을 제거하고 0.5mL STOP/Wash 완충액과 17mL의 물로 구성된 완충액에 슬라이드를 담급니다.
6. PBS에 슬라이드를 5분 동안 3회 담급니다.
7. 20μL의 Anti-Digoxigenin-Peroxidase를 실온에서 30분 동안 세포에 장착합니다.
8. 유리 슬라이드를 PBS에 5분 4회 담그십시오.
9. 30 mL의 50 mM Tris-HCl, 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride (DAB)의 전체 마이크로 주걱을 포함하는 pH7.5 및 0.002 % (v / v) H₂O₂ 30 초 동안 구성된 peroxidase 기판 용액에 유리 슬라이드를 담그십시오.
10. 세포사멸 세포가 갈색으로 염색될 때까지 위의 단계를 반복합니다. 유리 슬라이드를 물에 담궈 과산화효소 반응을 멈춥니다.
11. 관찰을 위해 세포를 물로 둘러쌉니다.

3. apoptotic cells의 phagocytosis 수준 측정

1. 식세포작용 수준을 평가하기 위해 광학 현미경으로 샘플을 관찰합니다. Croquemort 양성 세포 또는 GFP 양성 세포를 적혈구로, TUNEL 양성 세포를 apoptotic 세포로, 이중 양성 세포를 식세포작용 혈구로 계산합니다.
2. phagocytic index는 Croquemort 양성 세포 또는 GFP 양성 세포의 총 수에 대한 이중 양성 세포의 수로 정의됩니다. 300개 이상의 적혈구를 관찰하는 것이 좋습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
통 돼지 세럼	MP 바이오메디컬	55993	차단용
Kpl 항-쥐 IgG (H+L) Ab MSA, AP	KPL	475-1612	anti-Croquemort 항체를 사용한 stainig hemocytes에 대한 2차 항체
5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌릴 - 포스페이트	로슈	11383221001	BCIP, 혈구 염색용
니트로 블루 테트라졸륨	로슈	11383213001	NBT, 혈구 염색용
Anti-Croquemort 항체			문헌 [Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476]에서 상술하였다.
Apop 태그 과산화효소 현장 세포사멸 검출 키트	밀리포어	S7100	apoptoitc 세포의 염색용. 이 키트에는 평형 완충액, 반응 완충액, STOP/Wash 완충액, TdT 효소 및 항-디곡시제닌-과산화효소가 포함되어 있습니다.
3,3'- 디아 미노 벤지딘 테트라 하이드리 클로라이드	나칼라이 테스크	11009-41	DAB, apoptoitc 세포 염색용

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