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인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.
1. THP-1 단핵구 세포주의 배양 및 준비
- 배양 THP-1 단핵구를 37 °C + 5 % CO2에서 T25 플라스크에서 현탁액 배양으로 배양합니다. 세포는 Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) 5 mL + 10% 소 태아 혈청(FBS)에서 성장해야 합니다.
- 매일 플라스크를 부드럽게 흔들어 성장 배지 전체에 걸쳐 세포를 고르게 부유시킨 다음 즉시 혈구계로 세포를 계수합니다. 세포 밀도가 1 x 106 cells/mL에 도달하면 세포를 계대시해야 합니다.
- 37°C 수조에서 RPMI 1640 + 10% FBS를 예열합니다.
- 2 x 105 세포를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브 또는 15mL 코니컬 튜브로 옮기고, 실온에서 5분 동안 500 x g로 원심분리하여 펠릿 세포를 옮깁니다.
- 세포 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 제거하고 펠릿을 1mL(1.5mL 마이크로 원심분리 튜브) 또는 5mL(15mL 원뿔형 튜브)의 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁합니다.
- 실온에서 500 x g의 튜브를 5분 동안 원심분리하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 PBS를 제거합니다.
- 1mL의 새로운 RPMI 1640 + 10% FBS에 펠릿을 재현탁합니다.
- 새로운 T25 플라스크에 4mL의 데운 배지를 넣고 여기에 1.2.5의 재현탁 세포를 추가합니다. 세포가 계대 배양이 필요할 때까지(일반적으로 3일) 또는 실험에 세포가 필요할 때까지 37 °C + 5% CO2 인큐베이터에서 배양합니다.
- THP-1 유래 대식세포를 사용한 실험의 경우, 계대배양 전에 플라스크와 플레이트에서 필요한 수의 세포를 제거합니다.
- 필요한 수의 18mm 원형 유리 커버슬립(#1.5 두께)을 12웰 플레이트의 웰에 넣습니다(일반적으로 조건 및/또는 시점당 1개의 커버슬립). 각 웰 분취액 5 x 104 THP-1 단핵구. 필요한 경우 각 웰에 추가되는 셀의 수를 변경할 수 있습니다.
- 37°C로 예열된 RPMI + 10% FBS를 사용하여 각 세포 함유 웰의 총 부피를 1mL로 올립니다.
- 각 웰에 100nM phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)를 첨가하고 3일 동안 배양하여 THP-1 단핵구가 대식세포 유사 세포로 분화
되도록 유도합니다.
2. J774.2 대식세포 세포주의 배양 및 준비
- 37 ° C + 5 % CO2에서 T25 플라스크에서 J774.2 세포를 배양합니다. 세포는 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium) + 10% FBS 5mL에서 성장해야 하며 배양액이 80-90% 포화도에 도달하면 계대배양해야 합니다. 계대 세포로:
- 플라스크에서 모든 매체를 제거하고 PBS 5mL로 한 번 상승시킵니다.
- 플라스크에서 PBS를 제거하고 5mL의 새 DMEM + 10% FBS로 교체합니다.
- 세포 스크레이퍼를 사용하여 플라스크 바닥을 긁어내어 배지의 세포를 현탁시킵니다. 세포를 여러 번 격렬하게 피펫팅하여 세포 응집체를 분해합니다.
- 플라스크에서 세포 현탁액 4mL를 제거하고 4mL의 새로운 배지로 교체하여 세포를 1:5로 희석합니다. 남은 세포 현탁액은 폐기하거나, 새로운 T25 플라스크에서 새로운 세포 배양을 시작하는 데 사용하거나, 실험에 사용할 수 있습니다.
- J774.2 세포를 사용하여 efferocytosis assay를 설정하려면:
- 실험 시작 하루 전에 1.1.1–1.1.3 단계에 따라 J774.2 세포를 5mL의 새로운 배지에 현탁시킵니다. 혈구계를 사용하여 세포를 계수하고 5 x 104 cells/mL의 농도로 필요한 부피의 세포를 준비합니다.
- 필요한 수의 18mm 원형 유리 커버슬립(#1.5 두께)을 12웰 플레이트의 웰에 넣습니다. 각 웰 분취액 1 mL에 5 x 104 cells/mL 세포 현탁액을 주입합니다.
- 세포가 커버슬립에 부착되고 패시징에서 회복될 수 있도록 하룻밤 동안 배양합니다.
3. 일차 인간 M2 대식세포의 배양
- 필요한 M2 대식세포 12웰 플레이트당 헤파린화된 인간 혈액 10mL를 수집합니다.
- 15mL 원심분리 튜브에서 예열된 림프폴라이트-폴리 세포 분리 배지 5mL 위에 인간 혈액 5mL를 층을 이룹니다. >5mL의 혈액을 처리하는 경우 더 큰 부피의 튜브를 사용하는 것보다 여러 개의 튜브를 준비하십시오.
- 300 x g에서 35분 동안 중간 가속도를 사용하고 중단 없이 원심분리기를 사용합니다.
- 플라스틱 피펫터를 사용하여 상부 단핵 세포가 풍부한 밴드를 조심스럽게 제거하고 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 3.2단계에서 여러 개의 튜브를 준비한 경우 밴드를 단일 50mL 튜브로 모을 수 있습니다. PBS를 사용하여 튜브 부피를 최대 50mL까지 가져옵니다.
- 300 x g에서 8분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다. 이 단계에서 직경 18mm의 원형 커버슬립(#1.5 두께)을 12웰 플레이트의 각 웰에 고압증기멸균합니다.
- 원하는 웰 수당 300μL의 무혈청 RPMI 1640에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 예를 들어, 10mL의 혈액을 처리하여 전체 12웰 플레이트를 준비한 경우 3.6mL의 배지에 세포 펠렛을 현탁시킵니다.
- 300μL의 세포 현탁액을 12웰 플레이트의 각 커버슬립 함유 웰에 추가합니다. 37 ° C + 5 % CO2에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- 커버슬립을 1mL의 따뜻한 PBS로 부드럽게 세척하여 비부착성 세포를 제거합니다.
- RPMI 1640 + 10% FBS + 10ng/mL 재조합 인간 M-CSF + 세포 배양 항생제/항진균제 1mL를 추가합니다. 37 °C + 5% CO2에서 5일 동안 배양합니다.
- 배지를 RPMI 1640 + 10% FBS + 10ng/mL 재조합 인간 M-CSF + 10ng/mL 재조합 인간 IL-4 + 세포 배양 항생제/항진균제로 교체합니다. 37 ° C + 5 % CO2에서 2 일 동안 배양하여 M2 분극을 완료합니다.
- 편광 대식세포는 다음 3일 이내에 사용해야 합니다.
4. Apoptotic Jurkat 세포의 준비
- 37°C에서 5mL RPMI 1640 + 10% FBS + 5%CO2에서 Jurkat 세포를 배양합니다. Jurkat은 현탁 세포주이며 3-5일마다 미리 예열된 신선한 배지에 1:5로 전달하여 유지할 수 있습니다.
- 세포사멸 세포를 준비하려면 Jurkat 배양이 고밀도로 성장하도록 합니다(통과 후 4-5일). 1.5mL를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브와 펠릿 셀에 5분 동안 500 x g으로 원심분리하여 부분 표본을 추출합니다.
- 상층액을 버리고 1μM 스타우로스포린을 함유한 무혈청 RPMI 1640 배지 1mL에 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다.
- 37 °C + 5% CO2에서 16시간 배양하여 세포를 자멸사작용으로 만듭니다.
- 원하는 경우 Annexin V로 염색하여 세포사멸 유도를 확인합니다.
- 100μL의 스타우로스포린 처리된 Jurkat 세포 배양을 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 부분 표본으로 주입합니다. 500 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화하고, 상층액을 버리고, 100μL의 무혈청 RPMI 1640 배지에 세포 펠렛을 다시 현탁시킵니다.
- 1μL의 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 공액 Annexin V를 첨가하고 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 배양합니다.
- 900μL의 PBS를 추가하고 전체 부피를 18mm 원형 유리 커버슬립(#1.5 두께)이 포함된 12웰 플레이트의 단일 웰로 옮깁니다. 플레이트 어댑터가 장착된 원심분리기에서 200 x g로 1분 동안 스핀다운하여 세포가 커버슬립에 부착되도록 합니다. 또는 이미징을 위해 세포를 챔버 슬라이드에 배치할 수 있습니다.
- 형광 현미경을 사용한 이미지.
5. Fixed Cell Efferocytosis Assay 및 Inside-out Staining을 사용하여 Efferocytic 흡수 및 역학 정량화
- THP-1, J774.2 또는 M2 인간 대식세포를 각각 섹션 1-3에 설명된 대로 준비합니다.
- 실험 시작 전날 저녁에 섹션 4에 설명된 대로 apoptotic Jurkat 세포를 준비합니다.
- 실험 직전에 혈구계를 사용하여 세포사멸 세포를 계수합니다. 충분한 수의 세포사멸 세포를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 이동시킵니다 – 일반적으로 5 x 105 cells/well을 추가하여 10:1의 target:efferocyte 비율을 제공합니다.
- Jurkat 세포를 500 x g에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화하고 500μL의 PBS에 재현탁합니다.
- 원심분리 중에 10μL의 DMSO를 새로운 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 분취합니다. 최소량의 N-하이드록시숙시니미도비오틴(NHS-Biotin)을 DMSO에 용해시킵니다. 5-10개의 결정(~0.005mg)이면 충분합니다.
- 500μL 세포사멸세포/PBS 현탁액을 DMSO/NHS-비오틴 함유 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 세포 추적 염료를 제조업체에서 권장하는 농도로 apoptotic cell suspension에 희석합니다. FITC-Streptavidin과 스펙트럼적으로 겹치지 않는 세포 추적 염료(예: 적색 또는 원적외 세포 추적 염료
)를 선택해야 합니다.
- 어두운 곳에서 실온에서 20분 동안 현탁액을 배양합니다. 동일한 부피의 RPMI 1640 + 10% FBS를 추가하고 실온에서 어두운 곳에서 5분 동안 배양하여 미반응 염료를 담금질합니다.
- 500 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화하고, 상층액을 버리고, 대식세포 웰당 100μL의 RPMI 1640 + 10% FBS에 염색된 세포사멸세포를 다시 현탁시킵니다.
- 100μL의 염색된 세포사멸 세포 현탁액을 대식세포의 각 웰에 적가적으로 추가합니다. 플레이트 어댑터가 장착된 원심분리기에서 200 x g를 1분 동안 원심분리기를 사용하여 대식세포와 세포사멸 세포 사이의 접촉을 강제합니다.
- 조직 배양 인큐베이터에서 37 °C + 5% CO2에서 원하는 시간 동안 플레이트를 배양합니다. 대식세포의 경우, 발포세포화된 물질은 일반적으로 20-30분 후에 먼저 검출할 수 있으며 120-180분 후에 완료됩니다.
- 원하는 시점에 인큐베이터에서 세포를 제거합니다. 1mL의 실온 PBS로 세포를 두 번 세척하여 발포세포작용을 멈추고 비발포세포작용이 없는 세포사멸세포를 제거합니다.
- FITC-conjugated streptavidin을 1:1,000 희석으로 각 웰에 추가하고 어두운 곳에서 20분 동안 배양합니다. 이것은 비발포세포작용 세포사멸사 세포 물질에 노출된 비오틴을 라벨링합니다.
메모: 원하는 경우, Hoechst 33342 또는 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)의 1:20,000 희석액을 첨가하여 이 단계에서 세포핵을 염색할 수 있습니다.
- 1mL PBS로 세포를 3회 세척하고 헹굴 때마다 5분 동안 샘플을 부드럽게 흔들거나 흔듭니다. PBS에 4% 파라포름알데히드(PFA)가 함유된 셀을 실온에서 20분 동안 고정합니다. PBS로 세포를 한 번 헹구어 과도한 PFA를 제거합니다.
- 이미징을 위해 슬라이드에 커버 슬립을 장착하고 형광 현미경으로 옮길 수 있습니다. 정확한 정량화를 위해 충분한 수의 세포의 z-스택을 캡처합니다(일반적으로 조건당 10–30개의 세포). 내부화되지 않은 세포사멸 세포 물질은 FITC-스트렙타비딘 염색으로 둘러싸인 세포 추적 염료 표지 물질로 결과 이미지에서 명백하게 드러나며, 발포세포화된 물질은 스트렙타비딘 염색이 없는 개별 세포 추적 염료 반점을 형성합니다.
- 다양한 측정을 통해 결과 이미지의 efferocytosis를 정량화합니다.
- 대식세포당 개별 efferosomes(cell tracking dye+/streptavidin- puncta)의 평균 수를 결정하여 efferocytic index를 계산합니다. 자가사멸 세포에 결합하거나 ≥1 가시적 페페로솜을 포함하는 대식세포만 정량화합니다. 세포사멸세포(apoptotic cell)에 결합했지만 불연속적 효과솜(discrete efferosome)이 없는 대식세포를 발포세포 지수(efferocytic index)가 0인 것으로 기록합니다.
- ≥1 efferosome을 포함하는 대식세포의 비율을 측정하여 efferocytic efficiency를 계산합니다.
- 여러 시점에서 고정되고 염색된 세포를 이미징하여 efferocytosis의 속도를 계산합니다. apoptotic 세포에 결합하거나 가시적 페페로솜을 포함하는 이미지 대식세포만 이미지화할 수 있으며, 각 세포의 z-스택이 캡처됩니다. 이미징이 완료되면 efferocytosis의 속도를 결정합니다.
- streptavidin staining을 가이드로 사용하고 FIJI/ImageJ(또는 기타 이미지 분석 소프트웨어 패키지)의 자유형 또는 다각형 선택 도구를 사용하여 z-stack의 단일 평면에서 모든 세포 추적 염료+/streptavidin-(예: 내부화된) 재료에 동그라미를 칩니다. 이 영역에서 세포 추적 염료의 통합 강도를 측정합니다. 각 efferosome에 대한 개별 측정(예: 직경, 세포 경계 또는 핵에 대한 상대적 위치 등)은 이러한 측정과 동시에 쉽게 얻을 수 있으므로 분석 중에 수집되는 데이터가 크게 증가합니다.
- 동일한 z-섹션에서 streptavidin 염색을 가이드로 사용하고 자유형 또는 다각형 선택 도구를 사용하여 z-스택의 단일 평면에 있는 모든 세포 추적 dye+/streptavidin+(예: 내부화되지 않은) 재료에 동그라미를 칩니다. 식세포와 접촉하는 세포사멸세포(apoptotic cell)의 염색만 포함합니다. 이 영역의 통합 강도를 측정합니다.
- 이미지의 나머지 z 섹션에 대해 4.2.3.1에서 4.2.3.2 단계를 반복합니다. 발포세포화된(Σeff) 물질과 비발포세포작용된(Σne) 물질의 적분 강도를 합산합니다. 발포된 세포사멸 세포의 분율은 세포에 대해 다음과 같이 계산할 수 있습니다
- 모든 시점에서 모든 세포에 대해 efferocytosed 분획을 정량화합니다. apoptotic cells/efferosomes의 형광 강도는 개별 apoptotic cell에 의한 세포 추적 염료 흡수의 변화와 노출 시간과 같은 이미지 획득 매개변수의 변화로 인해 이미지마다 달라질 수 있습니다. 따라서 Fraction Efferocytosed와 같은 정규화된 값이나 efferocytic index 및 efferocytic efficiency와 같은 강도 독립적 값만 이미지 간, 실험 조건 간 및 반복 실험 간에 비교합니다.
- 결과 데이터 세트가 세포 간 efferocytosis의 변화를 정확하게 반영하도록 하려면 각 실험에서 가능한 최대 세포 수에 대해 이러한 분석을 수행합니다.
메모: 발포성 효율 및 발포성 지수는 빠르게 계산할 수 있으며(몇 초/셀), 일반적으로 실험당 최소 100개의 세포를 분석하고 각 실험을 최소 3번 반복하는 것을 목표로 합니다. 발포세포화된 물질의 비율을 계산하고 발포체에 특이적인 측정을 하는 것은 더 힘들며, 일반적으로 숙련된 분석가의 경우 셀당 2-3분이 소요됩니다. 이러한 계산을 위해 실험당 조건당 최소 15개의 셀을 정량화합니다.
- 세포별로 efferocytic index, fraction efferocytosed 및 개별 efferosome 데이터를 기록합니다.
메모: 이를 통해 단일 세포 접근법을 사용하여 데이터를 분석할 수 있으므로 세포 간 변동을 정량화할 수 있습니다. 개별 실험에서 획득한 단일 세포 데이터의 평균을 계산하여 이러한 데이터 세트에 대해 집단 수준 분석을 계속 수행할 수 있습니다. 에페로솜 특이적 측정은 집단 수준, 단일 세포 수준 및 앙상블로 분석할 수 있습니다(예: 이를 포함하는 세포와 독립적인 에페로솜의 집단으로).