Fixed Cell Efferocytosis Assay: 형광 현미경을 사용하여 대식세포에 의한 세포사멸 세포의 발포성 흡수를 연구하는 방법

초록

출처: Taruc, K., et al. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오에서는 컨포칼 현미경을 사용하여 세포사멸 세포의 청소를 연구하기 위한 efferocytosis assay를 시연합니다. efferocytosis는 apoptotic cell이 phagocyte에 의해 삼켜지고 efferosomes라고 하는 소포 내에서 분해되는 다단계 과정입니다. 이 프로토콜은 개별 세포사멸 세포의 내부화된 부분과 내부화되지 않은 부분을 시각화하고 efferocytosis를 정량화하는 방법을 제공합니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. THP-1 단핵구 세포주의 배양 및 준비

1. 배양 THP-1 단핵구를 37 °C + 5 % CO₂에서 T25 플라스크에서 현탁액 배양으로 배양합니다. 세포는 Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) 5 mL + 10% 소 태아 혈청(FBS)에서 성장해야 합니다.
2. 매일 플라스크를 부드럽게 흔들어 성장 배지 전체에 걸쳐 세포를 고르게 부유시킨 다음 즉시 혈구계로 세포를 계수합니다. 세포 밀도가 1 x 10⁶ cells/mL에 도달하면 세포를 계대시해야 합니다.
   1. 37°C 수조에서 RPMI 1640 + 10% FBS를 예열합니다.
   2. 2 x 10⁵ 세포를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브 또는 15mL 코니컬 튜브로 옮기고, 실온에서 5분 동안 500 x g로 원심분리하여 펠릿 세포를 옮깁니다.
   3. 세포 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 제거하고 펠릿을 1mL(1.5mL 마이크로 원심분리 튜브) ....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RPMI 1640 미디어	들소	3500-000-엘
DMEM 미디어	들소	Tel.: 319-005-CL
소 태아 세럼(FBS)	들소	제080-150
PBS (PBS)	들소	Tel.: 311-010-CL
18mm 원형 유리 커버 슬립 # 1.5 두께	전자 현미경 과학	72290-08	커버슬립의 크기와 모양은 중요하지 않지만, 세포 배양을 단순화하는 표준 12웰 플레이트의 웰에 18mm가 맞습니다.
스타우로스포린	케이맨 화학	81590	1mM에서 DMSO에 용해(1,000x 스톡 용액)
아넥신 V-알렉사 488	써모피셔	R37174
EZ-Link NHS-비오틴	써모피셔	20217	건조제에 보관하십시오. 원액을 준비하지 마십시오.
디엠소	시그마-알드리치	D2650
셀트레이스 파레드	써모피셔	C34572
셀트레이스 오렌지	써모피셔	C34851
회쉬 33342	써모피셔	62249
FITC-스트렙타바딘	써모피셔	SA1001
림프-폴리 세포 분리 배지	Cedarlane 연구소	CL5071
재조합 인간 M-CSF	페프로텍	200-04
재조합 인간 IL-4	페프로텍	300-25
J774.2 대식세포 세포주	시그마-알드리치	85011428-1VL
THP-1 인간 단핵구 세포주	증권 시세	TIB-202
Jurkat T 세포주	증권 시세	TIB-152

호 년 년 년 년 년 표시기 표시기 - 무수정유출