In Vitro Single Oocyte Reporter Assay: In Vitro 난모세포 성숙 중 표적 mRNA 번역 조절을 연구하는 기술

초록

출처: Costermans, N. G. J. et al., 단일 난모세포 리포터 분석을 사용하여 체외 성숙 중 모체 mRNA 번역 프로그램 정의. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오에서는 포스포다이에스테르 억제제가 존재할 때 난모세포 세포주기가 prophase-I에서 정지되며, 이 동안 전사된 mRNA가 번역이 없는 상태에서 저장되는 것을 보여줍니다. 억제제가 방출된 후 난모세포 성숙이 재개되고 세포는 중기에 들어갑니다. metaphase-I에서 타겟 유전자와 융합된 리포터 mRNA의 신호는 번역 기전과 단백질 발현의 활성화를 나타냅니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 미디어 준비

1. 표 1에 설명된 대로 모든 구성 요소를 추가하여 기본 난모세포 수집 배지와 난모세포 성숙 배지를 만듭니다. 염기성 수집 매체의 경우 pH를 7.4로 설정합니다. 채취 및 성숙 배지 모두에 대해 사용 당일 3mg/mL의 소 혈청 알부민(BSA)과 1μM 실로스타마이드를 추가합니다.

2. Ypet-3' UTR 및 mCherry를 위한 mRNA 인코딩 준비

1. 관심 mRNA의 3' UTR 염기서열을 얻습니다.
   메모: 이 연구를 위해 이전에 마우스 난모세포 cDNA에서 염기서열을 얻었습니다.
2. Ypet 코딩 서열, V5-항원결정기 태그 및 T7 프로모터를 포함하는 pcDNA 3.1 벡터의 일부와 난모세포 cDNA에서 타겟 3' UTR을 증폭하기 위한 설계 프라이머.
3. high-fidelity DNA polymerase kit를 사용하여 증폭합니다. 젤에 중합효소 연쇄 반응(PCR) 제품을 ....

결과

그림 1: 단일 난모세포 타임랩스 기록의 예. 전구기 I, MI(실로스타마이드 방출 후 6시간) 및 MII(실로스타마이드 방출 후 15시간)에서 Ypet/Interleukin-7 3' UTR 및 폴리아데닐화된 mCherry를 인코딩하는 mRNA를 주입한 단일 난모세포의 명시야, YFP 및 mCherry 기록. 눈금 막대 = 25μm. 약어: YFP = 황색 형광 단백질; GV = 생식 소포; MI = 중기 I; MII = 중기 II.

....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
배지 준비
소 혈청 알부민 파우더 Bioxtra	시그마-알드리치	시알-A3311
실로스타마이드	EMD 밀리포어	231085
MEM 알파	지브코	12561-056
최소 필수 미디엄 이글	시그마-알드리치	M2645
페니실린-스트렙토마이신 100x 용액, 멸균 여과	제네시 사이언티픽 코퍼레이션(GenClone)	25-512
중탄산나트륨	JT-베이커	3506년 1
나트륨 피루브산	지브코	제11360-070
초순수 증류수	인비트로젠	제10977-015
YFP/3' UTR 및 mCherry를 인코딩하는 mRNA의 제조
아가로스	에이펙스 바이오메디컬	20-102QD
카르베니실린 디소듐 염	시그마-알드리치	C1389-1G
Choo-Choo 클로닝 키트	맥랩	CCK-20
CutSmart 버퍼(10x)	뉴잉글랜드 바이오랩스	B7204
DNA 로딩 염료(6x)	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	R0611
dNTP 솔루션	뉴잉글랜드 바이오랩스	N0447S
디피엔아이	뉴잉글랜드 바이오랩스	R0176
GeneRuler 1kb DNA 사다리	써모 피셔	SM1333
100μg/mL 카르베니실린이 함유된 LB 한천 플레이트, Teknova	테크노바	L1010
LB 미디엄 (캡슐)	MP 바이오메디컬	3002-021
MEGAclear 전사 클린업 키트	생명 기술	AM1908
MfeI-HF 제한 효소	뉴잉글랜드 바이오랩스	R3589
mMESSAGE mMACHINE T7 전사 키트	인비트로젠	오전1344
Phusion High Fidelity DNA 중합효소	뉴잉글랜드 바이오랩스	M0530
폴리(A) 테일링 키트	인비트로젠	AM1350
QIAprep Spin Miniprep 키트	키아겐	27106
QIAquick 젤 추출 키트	키아겐	28704
S.O.C. 미디엄	써모 피셔	15544034
TAE 버퍼	에이펙스 바이오메디컬	20-193
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