In Vitro Single Oocyte Reporter Assay: In Vitro 난모세포 성숙 중 표적 mRNA 번역 조절을 연구하는 기술

초록

출처: Costermans, N. G. J. et al., 단일 난모세포 리포터 분석을 사용하여 체외 성숙 중 모체 mRNA 번역 프로그램 정의. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오에서는 포스포다이에스테르 억제제가 존재할 때 난모세포 세포주기가 prophase-I에서 정지되며, 이 동안 전사된 mRNA가 번역이 없는 상태에서 저장되는 것을 보여줍니다. 억제제가 방출된 후 난모세포 성숙이 재개되고 세포는 중기에 들어갑니다. metaphase-I에서 타겟 유전자와 융합된 리포터 mRNA의 신호는 번역 기전과 단백질 발현의 활성화를 나타냅니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 미디어 준비

1. 표 1에 설명된 대로 모든 구성 요소를 추가하여 기본 난모세포 수집 배지와 난모세포 성숙 배지를 만듭니다. 염기성 수집 매체의 경우 pH를 7.4로 설정합니다. 채취 및 성숙 배지 모두에 대해 사용 당일 3mg/mL의 소 혈청 알부민(BSA)과 1μM 실로스타마이드를 추가합니다.

2. Ypet-3' UTR 및 mCherry를 위한 mRNA 인코딩 준비

1. 관심 mRNA의 3' UTR 염기서열을 얻습니다.
   메모: 이 연구를 위해 이전에 마우스 난모세포 cDNA에서 염기서열을 얻었습니다.
2. Ypet 코딩 서열, V5-항원결정기 태그 및 T7 프로모터를 포함하는 pcDNA 3.1 벡터의 일부와 난모세포 cDNA에서 타겟 3' UTR을 증폭하기 위한 설계 프라이머.
3. high-fidelity DNA polymerase kit를 사용하여 증폭합니다. 젤에 중합효소 연쇄 반응(PCR) 제품을 실행하여 단편의 크기가 올바른지 확인하고 밴드를 잘라낸 다음 제조업체의 지침에 따라 겔 추출 키트를 사용하여 겔에서 DNA를 추출합니다.
4. PCR 클로닝 키트를 사용하여 PCR 단편을 벡터에 융합합니다.
   메모: PCR 단편을 보다 효율적인 재조합 과정을 촉진하기 위해 4시간 동안 얼음 위에서 배양했습니다. 이는 배양 시간을 45분으로 권장하는 제조업체의 지침에 위배됩니다.
5. PCR 단편을 유능한 5-α 대장균 박테리아로 transfection합니다.
   1. 혼합물과 플라스미드를 박테리아에 넣고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
   2. 혼합물을 42°C의 수조에 45초 동안 넣어 혼합물과 플라스미드에 열 충격을 가하고 즉시 얼음에서 3분 동안 냉각합니다.
   3. Catabolite repression (SOC) 배지와 함께 500 μL의 Super Optimal 육수를 첨가하고 37 °C에서 1 시간 동안 배양합니다.
   4. 7000 ×g에서 2 분 동안 스핀 다운하고 상층액을 대부분 제거합니다. 적절한 항생제를 선택하여 Luria Broth(LB) 한천 플레이트에 재현탁 및 플레이트합니다.
      메모: 이 연구에서는 카르베니실린이 사용되었습니다.
   5. 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 콜로니 중 하나에 피펫 팁을 가볍게 누르고 100μg/mL의 카르베니실린이 함유된 3mL의 LB 배지에 넣어 콜로니를 분리합니다. 37 °C에서 12-24 시간 동안 배양하십시오.
   6. 제조업체의 지침에 따라 plasmid DNA isolation kit를 사용하여 plasmids의 DNA를 추출하고 DNA sequencing을 통해 염기서열을 확인합니다.
6. Ypet/3' UTR의 경우:
   1. in vitro transcription을 위한 선형 PCR 템플릿을 생성합니다. Ypet 염기서열의 상류에 있는 전방 프라이머와 20개의 추가 티민 잔류물이 있는 리버스 프라이머를 사용합니다. Ypet/IL-7 3' UTR의 서열과 정방향 및 역방향 프라이머의 서열은 표 2를 참조하십시오.
      메모: 이러한 추가적인 티민 잔류물은 in vitro transcription 후 선형 mRNA에 oligo(A)를 추가합니다.
   2. 제조업체의 지침에 따라 T7 전사 키트를 사용하여 PCR 산물을 시험관 내에서 전사합니다.
   3. 생성된 상보적 RNA(cRNA)를 제조업체의 지침에 따라 transcription clean-up kit를 사용하여 정제합니다.
   4. 정제된 cRNA를 RNAse가 없는 물에서 용리시키고, 농도를 측정하고, 아가로스 전기영동으로 무결성을 평가합니다. -80 °C에서 보관하십시오.
7. mCherry의 경우:
   1. high-fidelity 제한 효소를 사용하여 in vitro transcription을 위한 선형 PCR 템플릿을 생성하고, 이 예시를 복제하는 경우 제한 효소 mfEI-HF를 사용합니다. 37 °C에서 밤새 분해 완충액으로 분해합니다.
   2. gel을 실행하여 샘플을 정제하고 제조업체의 지침에 따라 gel extraction kit를 사용하여 선형 DNA를 추출합니다.
   3. 제조업체의 지침에 따라 T7 전사 키트를 사용하여 PCR 산물을 시험관 내에서 전사합니다.
   4. 제조업체의 지침에 따라 폴리(A) 테일링 키트를 사용하여 cRNA(150-200 뉴클레오티드)를 폴리아데닐레이트합니다.
   5. 제조업체의 지침에 따라 transcription clean-up kit를 사용하여 생성된 cRNA를 정제합니다.
   6. 정제된 cRNA를 RNAse가 없는 물에서 용리시키고, mRNA 농도를 측정하고, 겔 전기영동을 통해 메시지 무결성을 평가합니다. -80 °C에서 보관하십시오.

3. 실험 절차

참고: 난모세포 미세주입 및 후속 타임랩스 현미경에 대한 개략적인 개요가 그림 1에 나와 있습니다.

1. 1일차
   1. 21일 된 생쥐에게 5IU의 임신한 암말 혈청 성선 자극 호르몬을 복강내 주사하여 전방 단계로의 난포 성장을 촉진합니다.
2. 3일차
   1. 난모세포 수집
      1. 26G 바늘로 난포 벽을 작게 잘라 전방 여포를 조심스럽게 엽니다. 입으로 작동되는 유리 피펫을 사용하여 온전한 적운으로 둘러싸인 난모세포(COC)를 여러 층의 적운 세포로 분리합니다.
      2. 더 작은 피펫(난모세포 직경보다 약간 큼)을 사용하고 반복적인 피펫팅을 통해 COC를 기계적으로 제거합니다.
         메모: 또는 온전한 COC에 마이크로 주입을 수행합니다.
      3. 더 큰 피펫을 사용하여 탈락된 난모세포를 흡인하고 1μM의 포스포디에스테라제 억제제인 실로스타마이드가 보충된 성숙 배지가 있는 페트리 접시에 넣어 감수분열 성숙의 재개를 방지합니다. 접시를 인큐베이터에 2시간 동안 넣어 난모세포가 난포에서 난모세포를 분리함으로써 유발된 스트레스에서 회복할 수 있도록 합니다.
   2. 난모세포 마이크로 주사
      1. 기계식 풀러에 10cm 길이의 붕규산 유리 모세관 튜브를 넣어 주사 바늘을 준비합니다. 최적의 주입을 위해 가열된 필라멘트를 사용하여 바늘 끝을 45° 각도로 구부립니다.
      2. 20μL의 염기성 난모세포 수집 배지로 폴리스티렌 접시를 준비하고 가벼운 미네랄 오일로 물방울을 덮습니다.
      3. 12.5 μg/μL Ypet-3' UTR과 12.5 μg/μL mCherry를 첨가하여 리포터 믹스를 준비합니다. 더 많은 부피를 준비하고 유사한 리포터 농도를 보장하기 위해 향후 실험을 위해 부분 표본을 만듭니다. 이 부분 표본은 -80 °C에서 보관하십시오. 해동 후 먼저 20,000 x g에서 2분 동안 부분 표본을 원심분리한 다음 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
         메모: 이 원심분리는 리포터 믹스의 잠재적인 응집체에 의해 주입 바늘이 막히는 것을 방지합니다.
      4. 캐필러리티에 의해 약 0.5μL의 리포터 혼합물로 주사 바늘을 로드합니다.
      5. 고정 피펫과 장전된 주사 바늘을 홀더에 놓고 난모 세포 수집 배지의 액적에 놓습니다. 배지의 일부를 고정 피펫에 흡입합니다.
      6. 주사 바늘을 잡고 있는 피펫에 부드럽게 두드려 엽니다.
      7. 염기성 채취 배지의 액적에 난모세포를 배치하고 리포터 믹스의 5-10pL를 주입합니다.
      8. mCherry 신호가 안정될 수 있도록 1μM 실로스타마이드로 성숙 배지에서 난모세포를 16시간 동안 배양합니다.
      9. 주입된 각 리포터에 대해 최소 2개의 20μL 성숙 배지 방울이 있는 타임 랩스 현미경 검사에 사용할 Petri 접시를 준비합니다: 전구기 I-arrested 난모세포를 제어하기 위한 1μM 실로스타마이드가 포함된 방울 1개와 성숙 난모세포를 위한 실로스타마이드가 없는 방울 1개. 물방울을 가벼운 미네랄 오일로 덮고 인큐베이터에 넣으십시오.
   3. 타임랩스 현미경 검사
      1. 사전 배양 후 인큐베이터에서 주입된 난모세포를 제거하고 실로스타마이드가 없는 성숙 배지에서 4회 세척합니다. 일부 난모세포를 1μM 실로스타마이드를 전구기 I-arrested 난모세포 대조군으로 사용하여 성숙 배지에 유지합니다.
      2. 주입된 난모세포를 미리 준비된 타임랩스 현미경 접시의 각각의 액적에 전달합니다. 밀폐된 유리 피펫을 사용하여 난모세포를 클러스터링합니다(닫힌 피펫은 팁을 몇 초 동안 화염에 담가두어 준비할 수 있음).
         메모: 난모세포를 클러스터링하면 기록 중 난모세포의 움직임을 방지하는 데 도움이 됩니다.
      3. 발광 다이오드 조명 시스템이 장착된 현미경 아래에 접시를 놓고 37°C 및 5% CO₂로 유지되는 환경 챔버가 장착된 전동 스테이지를 놓습니다. 이 연구를 재현하려면 다음 매개변수를 사용하십시오. 필터 세트: 이색성 거울 YFP/CFP/mCherry 69008BS; YFP 채널(여기(예): S500/20 × 49057; 방출(EM): D535/30m 47281), mCherry 채널(예: 580/25 × 49829; Em: 632/60m).
      4. 타임랩스 실험에 대한 적절한 설정을 입력합니다(이 연구에 사용된 소프트웨어는 재료 표 참조): 앱 | 다차원 획득. 첫 번째 탭 Main을 선택하고 타임랩스, 다중 스테이지 위치 및 다중 파장을 선택합니다.
      5. 저장 탭을 선택하여 실험을 저장해야 하는 위치를 입력합니다.
      6. 타임랩스 탭을 선택하여 시점 수, 지속 시간 및 시간 간격을 입력합니다.
         메모: 타임랩스 실험의 기간은 난모세포 감수분열 성숙 시기가 종마다 다르기 때문에 연구된 동물 종에 따라 다릅니다. 쥐 난모세포를 사용한 이 실험에서는 16시간 동안 15분마다 난모세포를 기록했습니다.
      7. 스테이지 탭을 선택합니다. 명시야를 켜고 Acquire | 획득 | 라이브 쇼. 난모세포를 찾으면 Multi-Dimensional Acquisition 창으로 다시 전환하고 +를 눌러 난모세포의 위치를 설정합니다.
      8. 파장 탭을 선택하고 명시야(노출 15ms), YFP(Ypet/IL7 3' UTR의 경우 노출 150ms) 및 mCherry(Ypet/IL7 3' UTR의 경우 노출 75ms)에 대해 3가지 다른 파장을 설정합니다.
         메모: 리포터 축적 수준과 주입된 볼륨에 따라 각 Ypet/3' UTR 리포터의 노출을 조정합니다. 병진 활성화 시 과소 평가 또는 포화를 방지하기 위해 실험 시작 시 YFP 신호가 검출 범위의 중심에 있는지 확인합니다. mCherry의 경우, 폴리아데닐화 절차 중에 추가된 아데닌 뉴클레오티드의 수에 따라 신호가 달라지므로 mCherry의 각 배치에 대한 노출을 조정합니다. 폴리아데닐화 효율의 차이로 인해 실험 간의 더 나은 비교를 위해 다른 실험에서 동일한 mCherry 배치를 사용하십시오.
      9. Acquire를 클릭하여 타임랩스 실험을 시작합니다. 단일 난모세포에서 타임랩스 기록의 예는 그림 1을 참조하십시오.
   4. Ypet-3' UTR 번역 분석
      1. 이 분석을 위해(이 연구에 사용된 소프트웨어는 재료 표 참조) 각 난모세포에 대해 두 가지 영역 측정을 수행합니다: 난모세포 자체를 클릭하여 타원 영역을 클릭하고 난모세포를 둘러쌉니다.그리고 배경 빼기에 사용할 난모세포에 가까운 작은 영역(직사각형 영역을 클릭)을 클릭합니다.
         메모: 타임랩스 기록 중에 난모세포가 선택한 영역 밖으로 이동하지 않는지 확인하십시오. 극체 돌출 주변의 영역 측정 위치에 특히 주의를 기울이면 난모세포에서 움직임이 발생하고 기록이 왜곡될 수 있습니다.
      2. 먼저 Open Log(로그 열기)를 클릭한 다음 Log Data(로그 데이터)를 클릭하여 데이터 분석 소프트웨어를 내보내어 지역 측정 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.
      3. 각 개별 난모세포 및 측정된 모든 시점에 대해 난모세포 영역 측정에서 배경 영역 측정값을 뺍니다. YFP 및 mCherry 파장에 대해 별도로 이 작업을 수행합니다.

표 1: 미디어 준비. 기본 난모세포 채취 배지 및 난모세포 성숙 배지를 준비하기 위해 추가해야 하는 구성 요소 목록입니다.

염기성 난모세포 수집 배지
구성 요소	500 mL의 경우
HEPES 수정 최소 필수 매체 독수리	7.1 지
중탄산나트륨	252의 mg의
나트륨 피루브산	1.15 밀리리터
페니실린/스트렙토마이신 100x	5 밀리리터
초순수 증류수 (Invitrogen, 10977-015)	최대 500mL
성숙 매체
구성 요소	500 mL의 경우
MEM 알파 1x	최대 500mL
나트륨 피루브산	1.15 밀리리터
페니실린/스트렙토마이신 100x	5 밀리리터

표 2: 리포터와 뇌관 순서의 예: YFP/IL7 3'UTR 리포터의 순서 그리고 시험관내 전사를 위한 선형 PCR 템플렛을 생성하기 위하여 이용된 앞으로와 반전 뇌관의 순서.

	순서
Ypet/인터루킨-7 3' UTR	GAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACCGGTCGCCACCGGTGAGCAAAGGCGAGAGCTGTTCACC GGCGTGGTGCCCATCCTGGTGGAGCTGGACGACGTGAACGGCCACAAGTTCAGCGTGAGCGGCGAGGGCGAGGGCGACGACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGCTGCTGTGCACCACCGGCAAGCTGGCACCACCGGCAAGCTG CCCGTGCCCTGGCCCACCCTGGTGACCACCCTGGGCTACGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGGTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGAGCGCCATGCCCGAGGGCTACGTGCAGGAGCGGACCA TCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGGGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGAACCGGATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGCCACAAGCTGGAG TACAACTACAACAGCCACAACGTGTACATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGGCACAACATCGAGGACGGCGTGCAGCTGGCCGACCACCACCACCACCCA TCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGAGCGCCCTGTTCAAGGACCCCAACGAGAAGCGGGACCACATGGTGCTGGGTGCTGGAGTTCCTGACCGACCGCCGCCGGCATCACCGAGGGC ATGAACGAGCTCTCTATAAGAGATCTTTCGAAGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGCGTACCGGTCATCATCACCATCACCATTGAACAGGACATGTAGTAACAACCTCCAAGAATCTACTGGTT CATATACTTGGAGAGGTTGAAACCCTTCCAGAAGTTCCTGGATGCCTCCTGCAAATAAGCCAAGCAGCTGAGAAATCTACAGTGAGGTATGAGATGATGGACACAGAAATGCAGCTGACTGCTGCCGTCAGCATATA CATATAAAGATATATCAACTATACAGATTTTTGTAATGCAATCATGTCAACTGCAATGCTTTTAAAACCGTTCCAAATGTTTCTAACACTACAAAGTCTACAAAAAGCAAGGCTATGAAGATTCAGAGTCACCACTGTTTTTTT AGCAAAATGATGGTATGGTTAAACATTCATTGGTGAACCACTGGGAGTGGAACTGTCCTGTTTTAGACTGGAGATACTGGAGGGCTCACGGTGATGGATAATGCTCTTGAAAACAAGAGTCTATCTTAAAGCAGCAG CAAAAAGAAGCTTAAGGCACTTAAGGCATCAACAAATGTAGTTAAATGAATGTATAACACATAACTTCAGTAAAGAGCATAGCAGATATTTTTAAATAAAAGTATTTTTAAAGATAGAAATGCACTTATTCCAAAGATACTGA ACCTTAGTATTCAGTCGCTTTTGACACTTGTGTATAATAAAGCTTATATAACTGAATTTTCAATTTGAAAAGTATATTTTTAAAAGAATAATATGCTAGACTTTTTTAATTAATGTATATGTATTTTTTTTTGGCATTCTGTCTCT CTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTATATATATATATATATATATATATATTCATATACTACCAATTGCGTACTTTGGATAGTCTCTTTTTAACCTAAATGACCTTTTTATTAACACTGTCAGGTTCCCTTACTCTCGAGAG TGTTCATTGCTGCACTGTCATTTGATCCCAGTTTTTGAACACACACATCCTTTAACACACACTCACGTCCAGATTTAGCAGGAGGACTAGGCTATAACTTTGTTAAGAGAGAAAACACTAATTTCTTGTTTTATGTAGGGTC TTATTCGTATCTAAGGCAGGCTAGGATTGCAGACATGAGCCAATATGCTTAATTAGAAACATTCTTTTTATGTTAAACTCATGTCTTTTACAAGATGCCTACATATATCCTATGTATATATGCCTGTTTAAATTTTTTTTTGTAAGGT CTGCTGTCTTCCTTCAGTTGTAATGGAAAGAAACACTATGTTGTAGAGGCCAAATTTCTGAAAGTGATAAGGGTTTGCTTGTACTGAATTCTCATTCTCCTTGCTTTTTCCAGCCACGTGAGCATCTAGCTATCTATACGCT GGATGTATTTGACCGATGCCTGCTCCACTGGCACATTGCATGTGTGGTAGCCATGCCTTCTTGCTTCTCCTTCCACCAACCCCTATAATGCTCTACTCAGTGGTACAGATAGCTGGGATTATCACAATTTTGAGAGAAAC ACCAATTGTTTAAAGTTTGTTTCATAATCACCATTTGCCCAGAAAACAGTTCTCTCAACTTGTTTGCAACATGTAATAATTTAAGAAACTCAATTTTGTTAATGGACTTTCGATAACTTCCTTAGATATCCCACATCTCCTAC GTCAGTCCTTTGTCCTGAGGAACTGGTAAAATGGGTAAGCCCTTAGCGAACTGAAGGCATTCGCATGTGTAAGATAATCTCTATACCTGCAAGGCTGTCTGGATGGCTCCCTACCAATATTGAACAATATTCTGATT TTGGCAAAATAAAGGATAATATTTT
포워드 프라이머	가가악캑트크트맥
리버스 프라이머	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCC

결과

그림 1: 단일 난모세포 타임랩스 기록의 예. 전구기 I, MI(실로스타마이드 방출 후 6시간) 및 MII(실로스타마이드 방출 후 15시간)에서 Ypet/Interleukin-7 3' UTR 및 폴리아데닐화된 mCherry를 인코딩하는 mRNA를 주입한 단일 난모세포의 명시야, YFP 및 mCherry 기록. 눈금 막대 = 25μm. 약어: YFP = 황색 형광 단백질; GV = 생식 소포; MI = 중기 I; MII = 중기 II.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
배지 준비
소 혈청 알부민 파우더 Bioxtra	시그마-알드리치	시알-A3311
실로스타마이드	EMD 밀리포어	231085
MEM 알파	지브코	12561-056
최소 필수 미디엄 이글	시그마-알드리치	M2645
페니실린-스트렙토마이신 100x 용액, 멸균 여과	제네시 사이언티픽 코퍼레이션(GenClone)	25-512
중탄산나트륨	JT-베이커	3506년 1
나트륨 피루브산	지브코	제11360-070
초순수 증류수	인비트로젠	제10977-015
YFP/3' UTR 및 mCherry를 인코딩하는 mRNA의 제조
아가로스	에이펙스 바이오메디컬	20-102QD
카르베니실린 디소듐 염	시그마-알드리치	C1389-1G
Choo-Choo 클로닝 키트	맥랩	CCK-20
CutSmart 버퍼(10x)	뉴잉글랜드 바이오랩스	B7204
DNA 로딩 염료(6x)	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	R0611
dNTP 솔루션	뉴잉글랜드 바이오랩스	N0447S
디피엔아이	뉴잉글랜드 바이오랩스	R0176
GeneRuler 1kb DNA 사다리	써모 피셔	SM1333
100μg/mL 카르베니실린이 함유된 LB 한천 플레이트, Teknova	테크노바	L1010
LB 미디엄 (캡슐)	MP 바이오메디컬	3002-021
MEGAclear 전사 클린업 키트	생명 기술	AM1908
MfeI-HF 제한 효소	뉴잉글랜드 바이오랩스	R3589
mMESSAGE mMACHINE T7 전사 키트	인비트로젠	오전1344
Phusion High Fidelity DNA 중합효소	뉴잉글랜드 바이오랩스	M0530
폴리(A) 테일링 키트	인비트로젠	AM1350
QIAprep Spin Miniprep 키트	키아겐	27106
QIAquick 젤 추출 키트	키아겐	28704
S.O.C. 미디엄	써모 피셔	15544034
TAE 버퍼	에이펙스 바이오메디컬	20-193
초순수 브롬화 에티듐 용액	생명 기술	15585011
난모세포 수집
교정된 마이크로 피펫을 위한 흡인기 튜브 어셈블리	시그마-알드리치	A5177-5개
교정된 마이크로 피펫	드러먼드 사이언티픽 컴퍼니	2-000-025
증권 시세 표시기 5000	마이바이오소스	MBS142665
PrecisionGlide 바늘 26G×1/2	BD (영어)	305111
주사기 1ml	BD (영어)	309659
난모세포 마이크로 주사
35mm 접시 | No. 0 커버슬립 | 20mm 유리 직경 | 코팅	매트텍	P35G-0-20-C	타임 랩스 현미경 검사용
필라멘트가 있는 붕규산 유리	셔터 계기	BF100-78-10
배아 배양을 위한 오일	어바인 사이언티픽	9305
페트리 접시	송골매	351006	마이크로 주입용
조직 배양 접시	송골매	353001	난모세포 배양용
VacuTip 홀딩 캐필러리	에펜도르프	5195000036
소프트웨어
바이오렌더	바이오렌더		그림 1S의 준비
MetaMorph, 버전 7.8.13.0	분자 장치		타임 랩스 현미경 검사의 경우 3' UTR 번역 분석

년 년 월 호 호 ) 년 년 년 년 년 (영어)