Gut Acidification Monitoring Assay: Bromophenol Blue Dye를 사용하여 초파리의 장 내강을 산성화하는 방법을 연구하는 기법

초록

출처: Abu, F., et al. 성인 초파리 장에서 장 산성화 모니터링. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 초파리 파리의 장 산성화를 모니터링하기 위한 분석을 보여줍니다. pH 지시 염료가 보충된 식품을 섭취한 후 장 내강(intestinal lumen)의 산성화로 인해 염료의 색이 변합니다. 색깔 변화를 검사하기 위해 파리의 소화관을 육안으로 검사하면 산성화의 증거가 나타납니다.

프로토콜

참고: 표준 실험실 라인 Oregon R은 WT 컨트롤로 사용되었습니다. 모든 파리는 12/12h 라이트/다크 일주기 리듬으로 실온에서 표준 옥수수 가루 당밀 배지(당밀, 한천, 효모, 옥수수 가루, 테고셉트, 프로피온산 및 물 포함)에서 사육되었습니다.

1. 분석 준비

1. CO₂ 마취 하에 암컷 파리(0-2일령, 처녀가 아님)를 수집하고 실험 전 최소 3일 동안 표준 옥수수 가루 사료로 회복할 수 있도록 합니다.
2. ~24mL의 탈이온수로 적신 실험실용 티슈가 들어 있는 바이알에 실온(~23°C)에서 ~24시간 동안 파리를 굶깁니다.
3. 다음과 같이 브로모페놀 블루(BPB)가 함유된 플라이 푸드를 준비합니다.
   1. 플라이 푸드를 전자레인지에 녹인 후 미지근해질 때까지 식힌다.
   2. 미지근한 음식 1mL에 BPB 4% 1mL를 넣고 잘 섞는다.
   3. 피펫을 사용하여 BPB가 포함된 플라이 푸드를 페트리 접시 중앙의 단일 점(~200 μL)에 추가합니다.

2. 장 산성화 모니터링 분석

1. 굶주린 파리를 2% 브로모페놀 블루(BPB)가 보충된 단일 점(200μL)의 파리 먹이가 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다. 파리가 빛에 노출된 동안 실온에서 4시간 동안 먹이를 찾도록 합니다.
2. 4 시간 후에, 파리를 모으고 얼음에 그(것)들을 마취하십시오; 외과적으로 그들의 내장을 고립시키십시오.
   1. 실체현미경으로 겸자로 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 수술을 수행합니다(재료 표 참조). 한 쌍의 집게로 흉부를 잡고 장의 CCR이 보일 때까지 두 번째 쌍으로 복부를 당겨 장을 분리하고 장이 양쪽 끝에 붙어 있는지 확인합니다.
3. 장의 CCR 색깔을 검사하여 장의 산성화를 측정합니다(그림 1C, 노란색은 산성화, 파란색은 산성화되지 않았음을 나타냄).
4. 내장에서 강력한 BPB 얼룩을 보이는 파리만 세십시오.
5. 다음 방정식을 사용하여 백분율을 계산합니다.
   산성화된 내장을 가진 파리의 비율 = 산성화된 파리의 수 × 100 / (산성화된 파리의 수 + 산성화되지 않은 파리의 수)
   메모: 백분율 0은 파리가 장을 산성화하지 않았음을 나타내고, 백분율 100은 모든 파리가 장을 산성화했음을 나타냅니다.

결과

그림 1: 장내 산성화 모니터링.(A) 먹이 경기장의 개략도. 파란색 점은 브로모페놀 블루(pH 표시 염료)가 함유된 플라이 푸드를 나타냅니다. 다른 반점은 초파리를 나타냅니다. (B) 4시간 동안 다양한 기간 동안 먹이를 먹인 장 산성화를 보여주는 파리의 비율을 그래픽으로 표현한 것. 산성화된 장과 산성화되지 않은 장의 대표적인 장 이미지. 빨간색 화살표는 중장의 구리 세포 영역에서 산성 방출을 나타냅니다. n = 4 개의 실험, 실험 당 25-30 마리의 암컷 파리. 스케일 바 = 각각 500μm. 별표는 대조군과의 유의한 차이를 나타냅니다(일원 분산 분석, Bonferroni 검정) *P < 0.05; **P < 0.01; P ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
브로모페놀 블루	시그마-알드리치		나0126
D. 시뮬란	캘리포니아 대학의 초파리 종 재고 센터		리버사이드 캘리포니아1 (https://www.drosophilaspecies.com/)
D. 에렉타	캘리포니아 대학의 초파리 종 재고 센터		데레 cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)
D. 슈도옵스큐라	캘리포니아 대학의 초파리 종 재고 센터		유진, 오리건(https://www.drosophilaspecies.com/)
D. 모하벤시스	캘리포니아 대학의 초파리 종 재고 센터		캘리포니아 초콜릿 마운틴 (https://www.drosophilaspecies.com/)
집게	이녹스 생물학		카탈로그# 11252-20
킴은 티슈를 닦습니다.	(주)킴텍
오레곤 R	블루밍턴 초파리 주식		(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)
페트리 접시	피셔 사이언티픽		카탈로그 #FB0875713A
인산염 완충 식염수(PBS)	하이클론		카탈로그 # SH30258.01
실체현미경	올림푸스 SZ51		시각적 확대