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1. 시약 및 용액
- 미토콘드리아 분리를 위한 MS-EGTA 완충액 500mL 만들기: 225mM 만니톨, 75mM 자당, 5mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES), 1mM 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), KOH로 pH 7.4로 조정. 0.22μm 필터를 통해 멸균하고 4°C에서 보관합니다. 사용하기 전에 MS-EGTA 버퍼를 4°C로 예냉각해야 합니다.
- 100mL의 KCl 완충액을 준비합니다: 125mM KCl, 20mM HEPES, 1mM KH2PO4, 2mM MgCl2, 40μM EGTA 및 KOH로 pH를 7.2로 조정합니다. 실온에서 보관하십시오.
- 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 1mM 칼슘 그린-5N 스톡을 준비합니다. calcium green-5N 스톡은 -20 °C에서 분취하여 보관할 수 있습니다.
- Ca2+ 흡수를 위한 기질을 준비합니다.
- pH 7.4의 피루브산 나트륨 1M를 준비합니다. -20 °C의 부분 표본에 보관하십시오.
- 500mM 말레이트, pH 7.4를 준비합니다. -20 °C의 부분 표본에 보관하십시오.
2. 심장 미토콘드리아의 분리
- 제도적 기준에 따라 쥐를 안락사시키십시오.
메모: 제도적으로 승인된 안락사 방법의 경우, 생쥐는 이소플루오란 흡입으로 마취되고 자궁경부 탈구로 희생되었습니다.
- 흉강을 열고, 갈비뼈의 양쪽을 따라 절단하고, 심장 측면을 절단하고, 횡격막을 절단하고, 심장 조직을 절제하여 심장을 수집합니다.
메모: 이 프로토콜에서는 성체 마우스(약 120mg)에서 채취한 전체 심장에서 미토콘드리아 분리를 수행하며, 이는 3-4개의 실험에 충분해야 합니다. 간과 같은 다른 미토콘드리아가 풍부한 조직으로부터 미토콘드리아 분리를 위해 설명된 프로토콜에 따라 최대 200mg의 조직을 사용할 수 있습니다.
- 얼음처럼 차가운 25mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 조직을 철저히 헹구어 모든 혈액이 심실 밖으로 짜내도록 합니다.
메모: 심장에서 짜낸 액체가 맑아지면 심장이 충분히 헹궈집니다.
- 날카로운 가위를 사용하여 얼음처럼 차가운 1x PBS 5mL에 심장을 작은 조각으로 다집니다.
- PBS를 버리고 다진 심장 조직을 0.10-0.15mm 간격의 사전 냉각된 7mL 유리-Teflon Dounce 균질화기로 옮깁니다.
- 얼음처럼 차가운 MS-EGTA 완충액 5mL를 추가하고 조직 조각이 더 이상 보이지 않을 때까지(약 11스트로크) 샘플을 균질화합니다.
메모: 온전하고 기능적인 미토콘드리아를 얻는 것이 목표이므로 조직을 과도하게 균질화하지 마십시오.
- 균질액을 15mL 튜브로 옮깁니다.
- 균질액을 600 x g, 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 핵과 깨지지 않은 세포를 펠릿화합니다.
- 상층액을 새 15mL 튜브에 옮기고 10,000 x g, 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 미토콘드리아를 펠릿화합니다.
- 상등액을 버리고 미토콘드리아 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오.
- 얼음처럼 차가운 MS-EGTA 버퍼를 사용하여 미토콘드리아 펠릿을 두 번 세척합니다. 세척할 때마다 미토콘드리아 펠릿을 5mL의 MS-EGTA 완충액에 재현탁하고 10,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리한 다음 상등액을 버립니다.
- 최종 세척 후 상층액을 버리고 미토콘드리아를 100μL의 얼음처럼 차가운 MS-EGTA 완충액에 재현탁합니다. 미토콘드리아를 얼음 위에 두세요.
메모: 미토콘드리아는 1시간 이내에 실험에 사용해야 합니다.
- Bradford Protein Assay를 사용하여 미토콘드리아 단백질 농도를 측정합니다.
3. 플레이트 리더 기반 미토콘드리아 칼슘 흡수 측정
참고: 여기에서는 인젝터가 장착된 다중 모드 플레이트 리더를 사용하여 미토콘드리아 Ca2+ 흡수를 분석하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 반응물을 빛으로부터 보호하기 위해 자동 시약 주입기를 사용하여 운동 모드에서 calcium green-5N 형광(여기/방출 506/532nm)을 판독할 수 있는 모든 플레이트 리더를 사용할 수 있습니다.
- 플레이트 리더가 1,000초의 총 분석 시간 동안 매초 측정되어 calcium green-5N 형광의 동역학 판독을 수행하도록 프로그래밍합니다. 또한 30초, 150초, 300초, 480초 및 690초 시점에서 5μL의 CaCl2 용액을 분주하도록 시약 주입기를 프로그래밍합니다.
메모: CaCl2 주입 시기는 사용자 정의이며 실험 요구에 따라 조정할 수 있습니다.
- 사용할 CaCl2 용액으로 시약 주입기를 프라임합니다.
메모: CaCl2 용액의 농도는 사용자 정의이며, MPTP 개방을 트리거하는 데 필요한 Ca2+의 양을 적정하기 위해 후속 실행에서 조정할 수 있습니다.
- 200μg의 미토콘드리아를 96웰 플레이트의 개별 웰에 추가합니다.
- 미토콘드리아와 KCl 완충액의 총 부피가 197μL가 되도록 적절한 부피의 KCl 완충액을 웰에 추가합니다.
- 미토콘드리아 혼합물에 1μL의 1M 피루브산과 1μL의 500mM 말레이트를 추가합니다. 피펫을 사용하여 미토콘드리아를 부드럽게 혼합하고 실온에서 2분 동안 기질과 함께 배양하여 미토콘드리아에 에너지가 공급되도록 합니다.
- 1mM 칼슘 그린-5N 스톡 1μL를 추가합니다. pipetting.
로 부드럽게 섞습니다.
메모: calcium green-5N 염료를 첨가한 후 빛으로부터 반응을 보호하십시오.
- 사전 프로그래밍된 운동 프로토콜을 시작하고 calcium green-5N 형광을 모니터링합니다.