세포를 투과하는 펩타이드와 멤브레인의 상호작용을 연구하기 위한 형광 누출 분석

초록

출처: Konate, K. et al. 세포 침투 펩타이드에 의한 막 불안정화를 조사하기 위한 형광 누출 분석법. J. Vis. 특급 (2020년)

이 동영상은 형광 염료와 담금질제로 캡슐화된 대형 단층 소포(LUV)인 세포막 모방체를 사용하여 세포 투과 펩타이드와 세포막의 상호 작용을 연구하기 위한 형광 누출 분석에 대해 설명합니다.

프로토콜

1. 대형 단층 소포 (LUV)의 제조

1. 형광 누출 분석을 위한 세포막 모방체로 사용하기 위해 LUV를 준비합니다.
2. 해밀턴 유리 주사기 포스파티딜콜린(DOPC, 786.11g/mol), 스핑고미엘린(SM, 760.22g/mol) 및 콜레스테롤(Chol, 386.65g/mol)을 몰비 4:4:2로 혼합합니다. 지질 용액은 25mL 유리 둥근 바닥 플라스크에서 25mg/mL로 메탄올/클로로포름(3/1, 부피/부피) 용매에 용해된 각 지질의 원액에서 얻습니다. DOPC 4μmol, SM 4μmol 및 Chol 2μmol을 기준으로 각각 126μL, 117μL 및 31μL를 혼합하여 원액에서 지질 용액을 얻습니다.
   주의: 메탄올은 독성 및 인화성 용제이며 클로로포름은 독성 및 발암성입니다. 둘 다 후드 아래에서 적절한 보호 장치를 사용하여 처리해야 합니다.
3. 진공 상태에서 회전 증발기를 사용하여 60°C에서 45-60분 동안 건조된 지질 필름이 형성될 때까지
증발시킵니다.
4. 두 개의 스톡 HEPES 완충 용액을 준비합니다. 20mM HEPES(238.3g/mol) 및 75mM NaCl(58.44g/mol)을 혼합하여 HEPES 버퍼 1을 준비하고 pH를 7.4로 조정합니다. 20 mM HEPES와 145 mM NaCl을 혼합하여 HEPES 버퍼 2를 준비하고 pH를 7.4로 조정한다. HEPES 버퍼는 4 °C에서 1 개월 동안 보관할 수 있습니다 .
   메모: 삼투압계를 사용하여 버퍼의 삼투압을 확인하는 것이 좋습니다.
5. 멤브레인 불투과성 형광 염료 소광제 커플, 8-아미노나프탈렌-1, 3, 6-트리술폰산, 12.5mM(ANTS, 427.33g/mol)의 디소듐 염 및 45mM(DPX, 422.16g/mol)의 p-자일렌-비스피리디늄 브로마이드를 HEPES 완충 용액에 용해시켜 지질 수화 용액을 준비합니다. ANTS와 DPX를 혼합하면 노란색 용액이 생성됩니다. 12.5mM의 ANTS와 45mM의 DPX 농도를 달성하려면 21.4mg 및 76mg을 각각 4mL의 HEPES 완충액 1.
   에 용해시킵니다. 메모: 지질 수화 용액은 튜브를 알루미늄 호일로 감싸서 4°C에서 2주 동안 보관할 수 있습니다.
6. 건조된 지질 필름을 1mL의 지질 수화 용액으로 재현탁시키고 건조된 지질 필름이 용해될 때까지 볼텍싱하여 다층 소포(MLV)를 재구성합니다. 작은 지질 응집체가 이전 단계에 부정적인 영향을 미치므로 용액이 완전히 용해되었는지 확인하십시오. 또한 유리 둥근 바닥 플라스크의 벽을 확인하여 남아 있는 지질 필름이 없는지 확인하십시오.
   메모: 용액은 가용화 후에 유백색과 밝은 노란색으로 나타납니다.
7. 소포를 5번의 동결/해동 주기를 반복하여 단층 소포를 얻습니다. 동결 단계를 위해 유리 둥근 바닥 플라스크를 액체 질소에 30초 동안 넣은 다음 해동 단계를 위해 수조에 2분 동안 그대로 두어 각 사이클을 수행합니다.
   메모: 목욕물의 온도는 지질의 용융 온도보다 5-10°C 높아야 합니다.
8. 금속 압출기 캐니스터에 배치된 각 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 압출기 조각에 HEPES 완충액으로 예비 가습된 두 개의 필터 지지대를 삽입하여 지질 압출기를 준비합니다.
9. 하나의 필터 지지대 상단에 HEPES 가습 폴리카보네이트 멤브레인(0.1μm 기공 크기, 직경 25mm)을 놓습니다.
10. 두 개의 금속 압출기 캐니스터를 조립하고 나사로 조입니다.
11. 조립된 압출기를 홀더에 놓고 각 폴리테트라플루오로에틸렌 압출기 조각의 말단에 있는 적절한 구멍에 1mL 주사기를 넣습니다. 압출은 테스트된 액체가 한 주사기에서 폴리카보네이트 멤브레인을 통해 다른 주사기로 통과하는 것에 해당합니다.
12. 1mL 주사기 중 하나에 1mL의 HEPES 버퍼가 로드된 상태에서 압출기를 테스트하여 누출이나 문제가 없는지 확인합니다.
13. 1mL HEPES 버퍼를 MLV 샘플로 교체합니다.
14. 폴리카보네이트 멤브레인을 통해 한 주사기에서 다른 주사기로 MLV 샘플을 최소 21회 전달하여 압출을 수행하여 동일한 크기의 균일한 LUV를 얻습니다.
    메모: 압출은 지질 혼합물의 용융 온도보다 높은 온도에서 수행되어야 합니다.

2. LUV 정제

1. 캡슐화되지 않은 ANTS 및 DPX 초과분을 제거하기 위해 컬럼 정제를 준비합니다.
2. 0.01% NaN₃(65g/mol)의 수성 매질에 재현탁된 가교 덱스트란 겔(G-50)을 컬럼의 무색 부분 상단 아래 1cm까지 액체 크로마토그래피 컬럼(Luer Lock, Non-jacketed, 1.0cm x 20cm, 베드 용량 16mL)에 도입합니다.
3. 탭을 열고 액체가 흐르도록 하여 가교 덱스트란 젤을 가라앉힙니다.
4. 20mL의 HEPES 버퍼 2로 용리하여 컬럼을 세척하고 컬럼의 출력 흐름을 버립니다.
5. 컬럼 위의 용매의 데드 부피(dead volume)가 최소화되면(<100 μL) 가교 덱스트란 겔의 건조를 방지하기에 충분하면 탭을 닫습니다.
6. 갓 압출된 LUV(노란색)를 컬럼에 놓고 가교 덱스트란 겔에 들어가도록 합니다.
7. HEPES 버퍼 2를 컬럼에 지속적으로 추가하여 LUV 정제를 수행합니다.
8. 약 2mL의 HEPES 완충액 2를 용리합니다(가교 덱스트란 겔이 건조되지 않도록 컬럼 상단을 정기적으로 채우는 것을 잊지 마십시오): 유리 노란색 ANTS 및 DPX 용액은 리포좀보다 느리게 이동합니다.
9. 튜브(1.5mL)에서 정제된 LUV를 수집하기 시작합니다.
10. 컬럼에서 용리액 방울을 관찰하고 유백색이 되면 리포솜이 포함되어 있습니다. LUV 함유 분획을 복구하도록 튜브를 교체하십시오.
11. 방울이 더 이상 유백색이 아닐 때까지(~1mL) 용리합니다. 그런 다음 별도의 분획에 0.5mL를 더 용리한 다음 용리를 중지합니다.
    참고: 이제 표준물질은 LUV의 용리 부피를 보정하기 위한 키트 또는 개별 분자량으로 광범위한 분자량으로 사용할 수 있습니다.
12. LUV가 있는 튜브를 알루미늄 호일로 감싸 형광 염료의 표백을 방지합니다.
13. 20mL HEPES 완충액 2로 컬럼을 세척합니다.
14. 그런 다음 LUV는 4°C에서 일주일 동안 보관할 수 있습니다.
    참고: LUV 안정성은 LUV 농도 및 구성, 이온 강도에 따라 달라질 수 있으므로 LUV의 크기는 동적 광 산란(DLS) 기기를 사용하여 제어해야 합니다(섹션 4 참조). LUV 크기 및 균질성의 특성화)를 각 테스트 전에 수행할 수 있습니다.

3. LUV의 농도 정량화

1. 콜린 농도를 평가할 수 있는 인지질 정량화 키트로 LUV 농도를 추정합니다. 이 분석은 극성 머리를 함유한 콜린이 있는 인지질이 상당한 경우(LUV의 >50%)에 적용될 수 있습니다.
2. 제공된 완충액 3mL에 18mg의 발색 기질을 용해시켜 색상 시약을 준비합니다.
3. 10 x 10 x 45mm의 폴리스티렌 큐벳에 3mL의 색상 시약을 로드합니다.
4. 순색 시약을 빈 상태(Blank)로 사용합니다. 20μL의 LUV 샘플(테스트) 또는 알려진 콜린 농도의 표준 용액 20μL(표준)를 추가합니다.
5. 잘 섞어 37°C의 모든 조건(블랭크, 테스트 및 표준)에서 5분 동안 배양합니다.
6. 분광 광도계를 사용하여 600nm에서 블랭크 용액을 제어로 사용하여 테스트 샘플과 표준 용액의 흡광도(광학 밀도, OD)를 측정합니다.
7. 알려진 농도의 표준과 비교하여 LUVs, C[LUV]의 지질 농도를 콜린과 동등하게 추정할 수 있는 OD 값을 확인하십시오.
8. 다음 방정식을 사용하여 계산을 수행합니다.
   C [LUV] (mol / l) = (OD 샘플 / OD 표준) x C [표준] (mol / l)
   노트: 인지질 정량 키트는 염화콜린 제공 (139.6 mg/l) C의 몰 농도에 해당하는 mg/dL의 표준 용액[표준] = 3.87 mmol/L. OD 샘플 및 OD 표준은 LUV 및 콜린 용액에 대해 600 nm에서 측정된 흡광도입니다., 각각
.

4. LUV 크기 및 균질성의 특성화

1. LUV 크기(nm) 및 다분산 지수(PdI)를 결정하기 위해 DLS 기기를 사용하여 측정을 수행합니다.
2. 용매/완충액과 사용된 큐벳의 점도를 표시하여 적절한 "표준 작업 절차"(SOP)를 프로그래밍합니다.
3. LUV 용액 500μL를 폴리스티렌 세미 마이크로 큐벳에 넣습니다.
4. 폴리스티렌 세미 마이크로 큐벳을 DLS 기기에 삽입합니다.
5. 실온에서 입자 분포의 평균 크기(Z-평균)와 균질성(다분산 지수, PdI)의 관점에서 크기 분포를 측정합니다.
6. 모든 결과는 각각 세 번의 반복 주기로 수행된 두 개의 독립적인 측정에서 얻은 것입니다.
   참고: LUV의 표준 값은 PdI가 0.149 ± 0.041인 137 ± 7nm의 평균 크기입니다.

5. 펩타이드 용액 준비

1. 누출 분석을 위해 분석해야 하는 펩타이드의 원액을 준비합니다.
2. 펩타이드 분말(>95% 순도)을 순수(예: 500μL 순수에 1mg 펩타이드)에 용해시킵니다.
   메모: 펩타이드를 순수한 물에 희석하고 인공물(예: 멤브레인 투과화)을 유발할 수 있는 디메틸 설폭사이드(DMSO) 가용화를 피하는 것이 좋습니다.
3. Vortex: 펩타이드 용액을 5초 동안 사용합니다.
4. 펩타이드 용액을 물 초음파 처리 수조에서 5분 동안 초음파 처리한 다음 12,225 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 농도 측정을 위해 상층액을 수집합니다.
5. 280nm에서 3개의 독립적인 펩타이드 희석액의 흡광도를 측정한 다음 몰 흡광 계수 ε(펩타이드 염기서열의 트립토판 및 티로신 함량에 따라 다름) 및 Beer-Lambert 규칙을 사용하여 펩타이드 농도를 계산합니다.
   메모: 펩타이드에 트립토판과 티로신이 포함된 경우 몰 흡광 계수 ε는 트립토판 ε = 5,690 ^{M-1 cm-1} 및 티로신 ε = 1,280 ^{M-1 cm-1}을 기준으로 계산됩니다. 펩타이드 서열에 트립토판 또는 티로신이 포함되어 있지 않은 경우, 농도를 측정하기 위해 다른 발색 분석을 수행할 수 있습니다(예: BCA 또는 Bradford).
6. 펩타이드 용액을 순수에 100μM의 최종 용액으로 희석하고 4°C에서 보관합니다.
   메모: 순수한 물에서는 4 °C 보관 중에 펩타이드 분해가 발생하지 않습니다. 그러나 펩타이드 농도는 수분 증발이 발생하지 않도록 2주마다 측정해야 합니다.

6. 형광 누출 분석

1. 형광 누출 분석은 실온에서 분광형광측정기에서 측정됩니다. 여기 파장과 방출 파장은 각각 Ex = 360nm ± 3nm 및 Em = 530nm ± 5nm로 고정됩니다.
2. LUV를 1mL HEPES 버퍼 2에서 석영 형광 큐벳의 최종 농도 100μM로 희석합니다. 실험 중에 용액을 균질화하기 위해 자석 교반기를 추가합니다.
3. 배경 형광에 액세스하기 위해 처음 100초 동안, t = 0초와 t = 99초 사이의 LUV만 측정합니다.
   메모: LUV만으로도 배경 형광 및 잠재적 누출에 접근하기 위해 전체 실험(15분) 동안 측정할 수 있습니다.
4. 그 후, 다음 900초(15분) 동안 펩타이드 용액의 분취량을 추가할 때 형광 강도의 증가로 누출을 측정합니다. 이 프로토콜은 0.1μM에서 2.5μM까지 테스트된 각 펩타이드 농도에 대해 수행됩니다.
5. 마지막으로, 1 μL의 Triton X-100 (0.1%, v/v)을 첨가하여 LUV를 용해시켜 100% 형광을 달성했으며, 그 결과 t = 1,000 s와 t = 1,100 s 사이에서 완전히 담금질되지 않은 프로브가 생성되었습니다.

7. 누출의 정량화

1. 테스트된 각 조건에 대해 동일한 점 수를 유지하기 위해 t = 1,090초 이후에 얻은 값을 억제합니다.
2. t = 0 s와 t = 49 s 사이의 50 포인트의 평균을 만들어 최소 형광 F_min을 계산합니다(LUV 단독).
3. t = 1,041초와 t = 1,090초 사이의 평균 50점을 만들어 최대 형광 F_max를 계산합니다(Triton X-100을 사용한 LUV).
4. 다음 방정식에 따라 각 시점(t = x)에서 누출 비율(%Leak)을 계산합니다.
   %누출_(t=x) = (F_(t=x) - F_최소) / (F_최대 - F_최소) x 100
5. 동일한 조건에 대해 다른 LUV 준비(n ≥ 2)로 얻은 값의 평균 및 표준 편차를 계산합니다.
6. 누설 비율 %Leak_(t=x)를 시간(s) 함수로 플로팅합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
25 mL 유리 둥근 바닥 플라스크	파이렉스
8-아미노나프탈렌-1, 3, 6-트리술폰산, 디소듐염(ANTS)	인비트로젠	A350	빛으로부터 보호
클로로포름	시그마-알드리치	288306
콜레스테롤	시그마-알드리치	C8667
DOPC(디올레오일포스파티딜콜린)	아반티 폴라	850375P	공기로부터 보호
압출 기	아반티 폴라	610000
형광측정기	PTI 세르라보
50 μL 유리 주사기	해밀턴	705엔
헤페스	시그마-알드리치	H3375 (영문
LabAssay 인지질	와코	Tel.: 296-63801
액체 크로마토그래피 컬럼	시그마-알드리치
메탄올	카를로 에르바	414902
핵공(nuclepore) 폴리카보네이트 멤브레인(0.1μm 기공 크기, 직경 25mm)	왓맨	800309
폴리스티렌 큐벳, 10 x 10 x 45 mm	그렌너 바이오 원	614101
폴리스티렌 세미 마이크로 큐벳, DLS	피셔 사이언티픽	FB55924
p-자일렌-비스피리디늄 브로마이드(DPX)	인비트로젠	X1525	빛으로부터 보호
석영 형광 큐벳	헬마	109.004F-QS
회전 증발 시스템	하이돌프	Z334898
Sephadex G-50 수지	아머샴	Tel.: 17-0042-01
아지드화나트륨(NaN3)	시그마-알드리치	시즌 2002
염화나트륨(NaCl)	시그마-알드리치	S5886
Sonicator 목욕 USC300T	폭스바겐	제142-6001
스핑고미엘린	아반티 폴라	860062P	공기로부터 보호
트리톤 X-100	에로메덱	2000-비
제타지저 NanoZS	맬 버 른	ZEN3500

년 ) 호 스