1. 식물 수집 및 가공
- 플랜트 샘플 수집 및 처리
- 식물 샘플을 채취한 후 집게로 식물 재료를 액체 질소에 담가 샘플을 급속 동결하고 -80°C에서 보관합니다. 수집된 식물 샘플이 너무 커서 급속 동결할 수 없는 경우 드라이 아이스를 사용하여 샘플을 빠르게 냉각하고 가능한 한 빨리 -80°C 냉동고로 옮깁니다. 식물 재료의 다량 영양소 함량은 조직이 식물에서 분리된 후 변할 수 있으므로 채취 후 가능한 한 빨리 식물 샘플을 동결하는 것이 중요합니다.
주의: 액체 질소는 피부와 접촉할 때 심한 동상을 유발할 수 있습니다. 액체 질소를 승인된 용기에 담아 운송하고 취급 중에는 냉동 장갑, 안대 고글, 안면 보호대, 앞치마, 실험복을 포함한 적절한 PPE를 착용하십시오.
- 동결 건조기를 사용하여 식물 재료를 동결 건조하여 물이 제거되는 동안 조직이 대사적으로 비활성화되도록 합니다. 샘플의 질량이 안정화되어 모든 물이 제거되었는지 확인할 때까지 건조시킵니다.
- 샘플이 건조되면 그라인더나 밀을 사용하여 미세한 분말로 분쇄합니다. 분석할 때까지 샘플을 건조 캐비닛에 보관하십시오.
2. 가용성 단백질 분석
- 시료 전처리
- 각 조직의 복제 샘플(각각 약 20mg)을 1.5mL 폴리스티렌 마이크로 원심분리기 튜브와 라벨 튜브에 계량합니다. 이러한 샘플은 이후에 미지 샘플이라고 합니다. 이 정보는 알려지지 않은 각 샘플의 %soluble protein을 계산하는 데 필요하므로 각 샘플의 정확한 질량을 기록하십시오. 잠금 덮개가 있는 마이크로 원심분리기 튜브를 사용하면 후속 가열 단계에서 잠기지 않는 뚜껑이 열려 샘플 용액이 손실될 수 있습니다.
- 미지 시료 단백질을 용해하고 분리합니다.
- 마이크로 피펫터를 사용하여 각 튜브에 500μL의 0.1M NaOH를 추가합니다. 뚜껑을 단단히 닫고 30분 동안 초음파 처리합니다. 온수 욕조를 90 °C.
로 예열합니다.
주의: 수산화나트륨은 강한 염기성이며 피부에 닿으면 화상을 입을 수 있습니다. 0.1M NaOH는 낮은 농도를 나타내지만 피부 자극을 피하기 위해 보호 장갑을 착용하십시오.
- 튜브를 뜨거운 물 욕조의 랙에 15분 동안 놓습니다.
- 15,000 x g의 원심분리기 튜브에서 10분간 작동. 각 샘플에 대해 새 피펫 팁을 사용하여 상등액을 새로 라벨링된 마이크로 원심분리 튜브에 피펫으로 넣습니다. 펠릿이 들어 있는 튜브에 0.1M NaOH 300μL를 추가하고 15,000 x g에서 10분 동안 다시 원심분리합니다. 다시 말하지만, 상층액을 채취하여 동일한 샘플의 다른 상등액과 결합하십시오. 이는 잠재적인 정지 지점이며, 필요한 경우 시료를 4°C에서 하룻밤 동안 보관할 수 있습니다.
- 식물 단백질을 침전시킨다
- 11 μL의 5.8 M HCl을 첨가하여 상등액 용액의 pH를 중화합니다. 각 샘플 용액에 리트머스 종이를 담궈 ~7의 pH를 확인합니다.
주의 : 염산은 피부와 접촉할 때(피부 적용 또는 흡입) 화상을 유발할 수 있는 강한 부식성 산입니다. HCl을 취급하는 동안 피부 자극을 방지하기 위해 장갑을 착용하십시오.
- 각 튜브에 90μL의 100% 트리클로로아세트산(TCA)을 추가하고 얼음 위에서 30분 동안 튜브를 배양합니다. 단백질의 침전은 용액을 투명에서 불투명으로 바꿉니다. 30분 후에도 이러한 현상이 발생하지 않으면 튜브를 1시간 동안 냉장 보관하십시오. 이것은 잠재적인 정지 지점이며 필요한 경우 샘플을 4°C에서 밤새 보관할 수 있습니다.
주의 : 트리클로로 아세트산은 부식성입니다. 취급 시 피부에 닿지 않도록 및 흡입을 피하기 위해 장갑을 착용하십시오.
- 13,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리기 샘플. 미세 유리 마이크로피펫 팁에 부착된 진공 라인을 사용하여 TCA 상층액을 흡입하여 조심스럽게 제거합니다(동일한 팁을 여러 샘플에 사용할 수 있음). 강한 흡입을 피하고 피펫 팁과 펠릿 사이에 적절한 거리를 유지하여 단백질 펠릿을 방해하지 마십시오.
- 100 μL의 -20 °C 아세톤으로 펠릿을 빠르게 세척합니다. 이 단계는 펠릿에 남아 있는 TCA를 제거하며, 이는 후속 Bradford 분석을 방해할 수 있습니다. 그러나 아세톤은 너무 오래 접촉하면 단백질 펠릿을 용해시키기 시작하므로 아세톤을 첨가한 다음 5초 이내에 펠릿에서 빠르게 추출해야 합니다.
- 튜브를 흄 후드나 냉장고에 넣어 아세톤이 증발하도록 합니다. 그런 다음 각 튜브에 0.1M NaOH 1mL를 첨가하여 단백질 펠릿을 용해합니다. 펠릿을 완전히 용해하려면 뜨거운 물 욕조에서 여러 차례의 가열, 와류 및 초음파 처리가 필요할 수 있습니다.
알림: 튜브가 흄 후드나 냉장고에 오래 보관되고 펠릿이 건조해질수록 재용해가 더 어려워집니다. 펠릿을 30분 동안 건조시킨 다음 아세톤이 증발한 것이 분명해질 때까지 10-15분마다 아세톤의 존재 여부를 확인하는 것이 좋습니다(아세톤 연기는 감지되지 않음).
- 표준 용액을 혼합하고, 미지 시료 용액을 희석하고, Bradford 분석을 사용하여 미지 샘플의 총 단백질 함량을 정량화합니다.
- 표 1에 나열된 농도에 따라 소 면역글로불린 G(IgG) 표준 용액을 준비합니다(동결건조 또는 IgG 원액을 탈이온수와 혼합하여 각 농도를 달성할 수 있음). 보관 기준은 4°C에서 보관합니다. 96웰 플레이트에서 웰 플레이트의 A1 위치에서 시작하여 각 IgG 표준 용액 160μL를 3회(A1, A2, A3 위치에서 0μg/μL, B1, B2, B3 위치에서 0.0125μg/μL 등)에 추가합니다.
- 증류수 950μL에 0.1M NaOH 50μL를 첨가하여 희석된 NaOH 용액을 준비합니다. 빈 음성 대조군으로, 이 용액 60μL를 웰 플레이트에 3회(G1, G2, G3 위치)로 추가합니다.
- 새로운 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 950μL의 증류수에 각 시료 용액 50μL를 추가하여 미확인 시료의 희석액을 준비합니다. 그런 다음 희석된 각 시료 60μL를 H1 위치에서 시작하여 30%씩 웰 플레이트에 추가합니다. 96웰 플레이트는 3회 판독 시 6개의 표준물질, 1개의 블랭크 샘플, 25개의 미확인 시료를 분석할 수 있어야 합니다. 분석된 각 웰 플레이트에는 자체 IgG 표준물질과 빈 샘플이 포함되어야 합니다.
- 100μL의 증류수를 모든 빈 샘플 웰과 알 수 없는 샘플 웰에 추가합니다. 이제 각 웰에는 총 160μL가 포함되어야 합니다. 다중 채널 피펫(8개 채널)을 사용하여 웰 플레이트의 첫 번째 열에 있는 모든 웰에 40μL의 Coomassie brilliant blue G-250 단백질 염료를 추가합니다. 염료를 샘플과 여러 번 섞습니다. 다른 모든 컬럼에 대해 반복하고 오염을 방지하기 위해 피펫 팁을 교체합니다.
주의 : Coomassie brilliant blue G-250은 자극성이므로 피부, 눈 또는 폐와의 접촉을 피해야 합니다. 피부에 닿지 않도록 장갑을 착용하십시오. 피부에 닿으면 본제품이 더러워집니다.
- 바늘을 사용하여 우물에 있는 기포를 터뜨리면 마이크로플레이트 분광광도계 판독을 방해할 수 있습니다. 우물 사이의 오염을 방지하기 위해 바늘을 청소하십시오. 마이크로플레이트를 실온에서 5분 동안 배양합니다.
- 마이크로플레이트 분광 광도계를 사용하여 595nm에서 각 웰의 흡광도 값을 기록합니다.
표 1. 용해성 단백질 분석을 위한 표준 곡선 계산.각 표준물질의 단백질 양은 각 표준물질의 농도에 각 웰의 표준용액의 양(160μL)을 곱하여 계산합니다.
호
개
개
호
호
세
| IgG 농도(μg/μL) | 표준 샘플의 단백질(μg) |
| 0.0000 | 0 |
| 0.0125 | 2 |
| 0.0250 | 4 |
| 0.0375 | 6 |
| 0.0500 | 8 |
| 0.1000 | 16 |
