식물 조직에서 비구조적 탄수화물의 정량화를 위한 비색 분석

초록

출처: Deans, C. A. et al. 옥수수(zea mays)를 예로 사용하여 식물 수용성 단백질과 소화 가능한 탄수화물 함량을 정량화합니다. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 식물 조직에 존재하는 소화 가능한 탄수화물을 정량화하는 방법을 설명합니다. 이는 다양한 식물 조직에서 데이터를 수집하여 영양 생태학, 식물-초식 동물 상호 작용 및 먹이-그물 역학을 연구하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 식물 수집 및 가공

1. 식물 샘플을 채취한 후 집게로 식물 재료를 액체 질소에 담가 샘플을 급속 동결하고 -80°C에서 보관합니다. 수집된 식물 샘플이 너무 커서 급속 동결할 수 없는 경우 드라이 아이스를 사용하여 샘플을 빠르게 냉각하고 가능한 한 빨리 -80°C 냉동고로 옮깁니다. 식물 재료의 다량 영양소 함량은 조직이 식물에서 분리된 후 변할 수 있으므로 채취 후 가능한 한 빨리 식물 샘플을 동결하는 것이 중요합니다.
   주의: 액체 질소는 피부와 접촉할 때 심한 동상을 유발할 수 있습니다. 액체 질소를 승인된 용기에 담아 운송하고 취급 중에는 냉동 장갑, 안대 고글, 안면 보호대, 앞치마, 실험복을 포함한 적절한 PPE를 착용하십시오.
2. 동결 건조기를 사용하여 식물 재료를 동결 건조하여 물이 제거되는 동안 조직이 대사적으로 비활성화되도록 합니다. 샘플의 질량이 안정화되어 모든 물이 제거되었는지 확인할 때까지 건조시킵니다.
3. 샘플이 건조되면 그라인더나 밀을 사용하여 미세한 분말로 분쇄합니다. 분석할 때까지 샘플을 건조 캐비닛에 보관하십시오.

2. 소화성 탄수화물 분석

1. 시료 전처리
   1. 각 조직의 복제 샘플(각각 약 20mg)을 고무 안감 나사 캡(길이 100mm)이 있는 유리 15mL 튜브에 넣습니다. 이러한 샘플은 이후에 미지 샘플이라고 합니다. 방수 마커 또는 뚜껑에 라벨링 테이프로 튜브에 라벨을 붙이고 각 샘플의 정확한 질량을 기록하십시오.amp이 정보는 알려지지 않은 각 샘플의 % 탄수화물을 계산하는 데 필요하므로 기록하십시오.
2. 알려지지 않은 각 샘플에서 소화 가능한 탄수화물을 추출합니다.
   1. 각 튜브에 0.1 M H₂SO₄ 1 mL를 추가하고 튜브에 캡을 단단히 조입니다. 끓는 물에 1시간 동안 담가둡니다.
      주의: 황산은 부식성이 매우 강합니다. H₂SO₄를 취급할 때는 장갑, 고글, 앞치마를 착용하고 흄 후드에서 이 단계를 수행하십시오.
   2. 미지근한 수조에서 튜브를 식히십시오. 라벨이 붙은 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 튜브 내용물을 붓습니다(유리관에 일부 식물 물질이 남아 있어도 걱정하지 마십시오).
   3. 15,000 x g의 원심분리기 튜브에서 10분간 작동. 마이크로 피펫터로 상층액을 제거하고 라벨이 붙은 새 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 이 시점에서 튜브는 밤새 냉장 보관할 수 있습니다. 분석을 계속하는 경우 2.3.2단계를 참조하십시오.
3. 표준 용액을 혼합하고 미지 샘플의 총 소화 가능한 탄수화물 함량을 정량화합니다.
   1. 표 1에 나열된 농도로 D(+) 포도당 표준 용액을 준비합니다. 각 표준물질 용액 400μL가 포함된 6개의 유리 시험관을 준비합니다.
   2. 각 미지 시료를 자체 시험관에 15μL씩 피펫팅하고 각 시료에 385μL의 증류수를 추가하여 각 시험관에 총 400μL를 주입합니다. 흄 후드에서 각 표준 및 미지 시료 시험관에 400μL의 5% 페놀을 첨가한 다음 농축된 H₂SO₄ 2mL를 각 튜브에 빠르게 피펫팅합니다. 피펫 팁으로 시험관 내용물을 만지지 말고 용액 표면에 추가하기만 하면 됩니다(이 경우 리피터 피펫이 가장 적합함).
   3. 튜브를 10분 동안 배양한 다음 튜브를 조심스럽게 소용돌이쳐 내용물을 혼합합니다. 추가로 30분 동안 배양합니다.
      주의: 페놀과 황산은 부식성 자극제입니다. 피부, 눈 및 흡입에 대한 노출을 방지하기 위해 이 단계는 안면 보호대 또는 고글, 고무 장갑, 실험실 앞치마 및 부츠를 포함하는 적절한 PPE를 사용하여 화학 흄 후드에서 수행해야 합니다. 페놀과 황산을 혼합하면 발열 반응이 일어나 튜브가 뜨거워집니다.
   4. 각 튜브의 시료 800μL를 폴리스티렌 1.5mL 세미 마이크로 큐벳 3개에 각각 피펫팅합니다(시료당 기술 반복 3회). 분광 광도계가 490nm에서 읽히도록 설정합니다. 표준물질 또는 알 수 없는 샘플을 판독하기 전에 증류수가 들어 있는 빈 큐벳으로 보정하고, 샘플 판독 전반에 걸쳐 간헐적으로 보정합니다. 분광 광도계를 통해 각 큐벳을 실행하고 흡광도를 기록합니다. 알 수 없는 각 샘플에 대한 기술적 반복실험의 평균입니다.
      메모: 경우에 따라 샘플이 상한 흡광도 임계값을 초과할 수 있습니다. 그렇다면 1.3.1단계에서 샘플을 희석해야 합니다. 희석량은 후속 계산에서도 고려해야 합니다.
   5. 각 표준의 평균 흡광도를 계산합니다.
      메모: 표준 곡선을 사용하여 알려지지 않은 각 샘플에 존재하는 총 소화 가능한 탄수화물의 양을 계산하려면 각 표준물질에 존재하는 D(+)포도당의 마이크로그램에 대해 각 표준물질의 평균 흡광도를 회귀 분석하는 것이 가장 쉽지만, 원하는 경우 각 표준물질의 D(+)포도당 농도(μg/μL)를 그래프로 나타낼 수도 있습니다. 그러나 다음 계산은 농도(μg/μL)가 아닌 마이크로그램을 기반으로 하는 표준 곡선을 참조합니다.
   6. 각 표준 용액의 D(+)포도당(μg) 총량에 대한 평균 흡광도를 표시하여 표준 곡선을 계산합니다. 이러한 데이터에 선형 회귀선을 맞춘 후 다음 방정식을 사용하여 각 미지 샘플의 총 탄수화물(μg)을 계산합니다.
      M_c = (((A_x – b)/m)/(15))*1000
      M_c = 샘플의 탄수화물 μg
      A_x = 미지 샘플의 평균 흡광도
      B = Y절편(표준 회귀선)
      m = 경사(표준 회귀선)
      이 선의 상관 계수는 0.98보다 커야 하고 일반적으로 0.99에 가까워야 합니다. 그런 다음 다음 방정식을 사용하여 각 샘플의 탄수화물 비율을 결정합니다.
      P_c = ((M_c/1000)/(M_i))*100
      P_c = % 탄수화물
      M_i = 샘플의 초기 질량(mg)

표 1. 소화 가능한 탄수화물 분석을 위한 표준 곡선 계산. 각 표준물질의 포도당 양은 각 표준물질의 농도에 각 시험관의 표준용액의 양(400 μL)을 곱하여 계산합니다

호 분 분 아까이서 의 아까 의 년 의

D(+)포도당 농도(ug/uL)	표준 샘플의 D(+)포도당(ug)
0.0000	0
0.0375	15
0.0750	30
0.1125	45
0.1500	60
0.1875	75

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마이크로플레이트 리더(분광 광도계)	Bio-Rad 모델	680 XR