동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 루시페라아제 기반 톡소플라스마 성장 분석
- 기생충 접종 1주일 전에 인간 포피 섬유아세포(HFF)를 파종하여 숙주 세포가 완전히 융합되도록 합니다. 평가 기간 동안 기생충이 세포 내에 남아 있는지 확인하기 위해 투명 플레이트에서 모의 분석을 수행합니다.
메모: 여기에서 분석은 96웰 마이크로플레이트에서 수행됩니다. 실험적 필요에 따라 최대 384웰 또는 1536웰 마이크로플레이트까지 확장할 수 있습니다.
- 완전히 용해된 기생충 ~0.3-0.4mL를 T25 플라스크에 옮겨 사용 2일 전에 톡소플라스마 기생충을 융합 HFF에 전달합니다. 감염된 숙주 세포를 37°C에서 5% CO2로 2일 동안 배양합니다.
- 갓 용해된 기생충 5mL를 21G 안전 바늘로 5회 주사기하여 세포 내 기생충을 방출한 다음 3μm 필터를 통과시켜 숙주 세포 파편을 제거합니다. 페놀 레드가 없는 D10 배지 7mL를 사용하여 플라스크에서 잔류 기생충을 헹구고 필터를 다시 통과시킵니다.
- 기생충을 1000 x g에서 실온(RT)에서 10분 동안 원심분리기. 상등액을 붓고 펠릿을 10mL의 페놀이 red-free D10 배지에 재현탁합니다.
- 농도를 결정하기 위해 혈구계를 사용하여 기생충을 계수합니다.
- 야생형(WT) 균주에 대해 기생충을 1 x 104 기생충/mL로 희석합니다. 성장이 결핍된 기생충 균주의 경우, 그에 따라 농도를 증가시켜 루시퍼라제 신호의 현저한 증가를 관찰합니다.
- HFF가 사전 파종된 96웰 마이크로플레이트에서 배지를 조심스럽게 흡입하고 3개의 기술적 복제물과 5개의 시점을 나타내는 3개의 열과 5개의 열 형식으로 150μL의 기생충 재현탁액을 웰에 접종합니다.
- 마이크로플레이트를 37°C 및 5% CO2에서 4시간 동안 배양합니다.
- 웰에서 배지를 조심스럽게 흡입하여 침입하지 않은 기생충을 제거한 다음 각 행(첫 번째 줄 제외)에 RT 페놀 무함유 배지로 웰을 채웁니다.
- 동일한 부피의 PBS와 2x luciferase 분석 버퍼를 혼합하고 luciferase 기질을 12.5μM로 희석합니다.
- 100μL의 희석된 루시페라제 기질을 맨 위 열의 각 웰에 추가합니다. 세포가 완전히 용해될 수 있도록 RT에서 10분 동안 마이크로플레이트를 배양합니다.
- 마이크로플레이트 리더를 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정합니다. 플레이트 리더 설정은 표 1에 나열되어 있습니다. 각 판독값은 감염 후 4시간에 침입한 기생충의 초기 수를 나타냅니다.
- 매체를 변경하지 않고 4일 동안 24시간마다 각 행에 대해 1.9-1.12단계를 반복합니다. 이 수치는 감염 후 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간에 복제된 기생충의 총 수를 반영합니다.
- 각 시점의 평균 판독값을 계산하고 이를 4시간에서의 평균 판독값으로 나누어 시간 경과에 따른 기생충 성장의 접힘 변화를 결정합니다.
- 그래프 소프트웨어를 사용하여 데이터를 플로팅합니다.
- 배가 시간을 계산하려면 배양 시간 동안 개별 시점에서 접힘 변화의 log2 값을 플로팅합니다. 선형 회귀 함수를 사용하여 각 변형률의 배가 시간을 나타내는 기울기를 계산합니다.
표 1: 루시페라제 기반 톡소플라스마 성장 분석 중 루시페라제 활성 측정을 위한 마이크로플레이트 리더 설정
의
| 루시페라아제: | 끝점 |
| 통합 시간: | 1들 |
| 필터 세트 - 방출: | 풀 라이트 |
| 광학: | 맨 위로 |
| 이득: | 135 |
| 읽기 속도: | 보통 |
| 지연: | 100 밀리세컨드 |
| 높이 읽기: | 4.5의 mm |
