기생충에 대한 항기생충 화학물질의 효능을 연구하기 위한 루시페라제 분석

초록

출처: Key, M., et al. 루시페라제 기반 성장 분석을 사용하여 세포 내 톡소플라스마 곤디 성장에 대한 화학적 억제제 효율 측정. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 세포 내 병원균인 톡소플라스마 곤디이에 대한 항기생충 화학 억제제의 효능을 결정하는 데 사용되는 루시페라아제 분석을 보여줍니다.이 연구는 루시페라아제 발현 기생충이 숙주 세포에 침입하여 복제하고 생존하는 것을 포함합니다. 화학적 억제제는 기생충의 시스테인 프로테아제와 결합하여 복제를 억제합니다. 검출된 루시퍼라제 활성은 기생충 성장의 주름 변화에 비례하여 기생충에 대한 약물의 효능을 결정합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 톡소플라즈마 성장에 대한 화합물 억제 효능 평가

참고: 여기에서는 톡소플라스마 성장에서 LHVS의 억제에 대한 평가가 예시로 제시됩니다. 8가지 다른 농도의 LHVS를 테스트하고 RHΔku80::NLuc 및 RHΔku80Δ cpl::NLuc 균주 모두에 대해 3가지 생물학적 복제물 각각에 대해 3가지 기술 복제를 수행합니다.

1. 기생충이 감염되기 전에 HFF를 3개 행과 9개 열 형식의 96웰 마이크로플레이트에 시딩하여 균주당 화합물당 하나의 생물학적 복제를 수행합니다. 숙주 세포는 사용하기 전에 최소 7일 동안 성장할 수 있습니다.
2. 사용하기 2일 전에 RHΔku80::NLuc 및 RHΔku80Δcpl::NLuc 기생충을 통과시킵니다.
3. 완전히 용해된 기생충 ~0.3-0.4mL를 T25 플라스크에 옮겨 사용 2일 전에 톡소플라스마 기생충을 융합 HFF에 전달합니다. 감염된 숙주 세포를 37°C에서 5% CO₂로 2일 동안 배양합니다.
4. 갓 용해된 기생충 5mL를 21G 안전 바늘로 5회 주사기하여 세포 내 기생충을 방출한 다음 3μm 필터를 통과시켜 숙주 세포 파편을 제거합니다. 페놀 레드가 없는 D10 배지 7mL를 사용하여 플라스크에서 잔류 기생충을 헹구고 필터를 다시 통과시킵니다.
5. 기생충을 1000 x g에서 실온(RT)에서 10분 동안 원심분리기. 상등액을 붓고 펠릿을 10mL의 페놀이 red-free D10 배지에 재현탁합니다.
6. 농도를 결정하기 위해 혈구계를 사용하여 기생충을 계수합니다.
7. 야생형(WT) 균주에 대해 기생충을 1 x 10⁴ 기생충/mL로 희석합니다. 성장이 결핍된 기생충 균주의 경우, 그에 따라 농도를 증가시켜 루시퍼라제 신호의 현저한 증가를 관찰합니다.
8. 페놀 레드가 없는 배지에 기생충을 1 x 10⁴ parasites/mL로 재현탁합니다.
9. 융합 HFF가 포함된 플레이트에서 배지를 흡입하고 각 웰에 150μL의 기생충 재현탁액을 접종합니다. 마이크로플레이트를 37°C 및 5% CO₂에서 4시간 동안 배양합니다.
10. 연속 희석을 통해 12웰 저장소에서 8가지 농도로 LHVS를 준비합니다. 일반적으로 농도는 연속 희석 방식으로 3배 감소합니다.
    메모: 가장 낮은 농도는 가장 높은 농도에 비해 6,561배 감소합니다. 희석액의 접힘 변화는 개별 화합물의 다른 특성에 따라 적절하게 조정될 수 있습니다.
11. 감염 후 4시간 후에 배지를 흡입하여 침입하지 않은 기생충을 제거하고 2-9열의 각 웰을 다양한 농도의 LHVS가 보충된 150μL의 배지로 채웁니다. 첫 번째 열을 일반 배지로 채워 처리되지 않은 대조군 역할을 하도록 둡니다.
12. 마이크로플레이트를 37°C 및 5% CO₂에서 추가로 96시간 동안 배양합니다.
13. 웰에서 배지를 조심스럽게 흡입하여 침입하지 않은 기생충을 제거한 다음 각 행(첫 번째 줄 제외)에 RT 페놀 무함유 배지로 웰을 채웁니다.
14. 동일한 부피의 PBS와 2x luciferase 분석 버퍼를 혼합하고 luciferase 기질을 12.5μM로 희석합니다.
15. 100μL의 희석된 루시페라제 기질을 맨 위 열의 각 웰에 추가합니다. 세포가 완전히 용해될 수 있도록 RT에서 10분 동안 마이크로플레이트를 배양합니다.
16. 개별 웰의 루시퍼라제 활성을 측정합니다.
17. 각 개별 LHVS 농도의 우물에서 3개의 기술적 복제물의 루시퍼라아제 활성을 평균화합니다.
18. 각 LHVS 농도에 대한 평균 루시퍼라제 활성을 처리되지 않은 기생충에서 파생된 평균 루시페라제 활성으로 나누어 정규화된 루시페라제 활성을 백분율로 계산합니다.
19. 그래프 소프트웨어를 사용하여 개별 LHVS 농도에 대해 정규화된 루시퍼라아제 활성을 플롯합니다(그림 1). 기생충 성장에 대한 피리메타민의 억제도 대조군으로 측정됩니다. 피리메타민(Pyrimethamine)은 톡소플라스마에서 엽산 대사를 억제하여 급성 톡소플라즈마증을 치료하는 데 사용되는 임상 항생제입니다.
20. "dose-response-inhibition" 회귀 프로그램에서 그래프 소프트웨어에 내장된 방법인 normalized response vs. [inhibitor]를 사용하여 개별 화합물에 대한 IC₅₀ 값을 계산합니다. IC₅₀은
    공식을 사용하여 계산됩니다. Y = 100 / (1 + X / IC₅₀)
    여기서: Y는 서로 다른 농도의 억제제에서 감염된 세포의 정규화된 루시페라제 활성을 나타내고, X는 억제제의 개별 농도를 나타냅니다.

결과

그림 1: 루시퍼라제 기반 성장 분석을 사용한 LHVS 및 피리메타민의 억제 효능 평가. 기생충을 숙주 세포의 침입을 허용하기 위해 4시간 동안 96웰 마이크로플레이트에 접종했습니다. 침입하지 않은 기생충을 씻어내고, 플레이트를 상이한 농도의 LHVS 또는 피리메타민을 함유하는 배지로 채우고 루시페라제 활성을 결정하기 전에 추가로 96시간 동안 배양했습니다. 개별 억제제 농도로 처리된 기생충에 대해 측정된 루시페라제 판독값은 처리되지 않은 기생충에서 검출된 신호에 대해 정규화되었습니다. 데이터는 그래프 프로그램에 표시되었으며 IC₅₀ 결정을 위한 회귀 분석이 수행되었습니다. 분석은 각각 3개의 기술적 복제물로 3개의 생물학적 복제로 반복되었습니다. 데이터는 평균 ± SEM, n = 3개의 생물...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Biotek Synergy H1 하이브리드 멀티모드 마이크로플레이트 리더	BioTek 제품
Coelenterazine h	프롤룸	재질 보기 301-10 hCTZ
소프트웨어
GraphPad Prism 소프트웨어(8번째 버전)