잘못 국소화된 TA 단백질의 제거를 연구하기 위한 Msp1 추출 분석

초록

출처: Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. 완전히 정제된 구성 요소로 Msp1 추출 활성의 재구성. J. Vis. 특급. (2021).

이 비디오는 리포좀의 지질 이중층에 통합된 잘못 국소화된 TA 단백질의 Msp1 매개 제거를 연구하기 위한 체외 프로토콜을 보여줍니다. Msp1 및 TA 단백질은 리포솜으로 동시 재구성되며, TA 단백질의 ATP 의존적 전좌는 친화성 정제를 통해 확인됩니다.

프로토콜

1. 리포좀 제제

1. 클로로포름 지질 스톡을 외부 미토콘드리아 막을 모방하기 위해 적절한 비율로 결합합니다.
   1. 지질 혼합물 25mg을 준비합니다. 우리는 닭고기 달걀 포스파티딜콜린(PC), 닭 달걀 포스파티딜 에탄올아민(PE), 소 간 포스파티딜 이노시톨(PI), 합성 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(DOPS) 및 합성 1',3'-비스[1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포]-글리세롤(TOCL)의 48:28:10:10:4 몰비로 구성된 미토콘드리아 막을 모방하는 이전에 확립된 지질 혼합물을 사용합니다. 샘플 계산은 표 1에 나와 있습니다.
   2. 결로를 제한할 수 있으므로 개봉하기 전에 모든 지질 스톡을 실온으로 가져오십시오. 대부분의 실험실에는 지질의 농도를 정확하게 측정할 수 있는 방법이 없기 때문에 클로로포름 원료에 의해 흡수된 모든 물은 지질 원료의 농도를 변화시켜 분석에 사용되는 지질의 비율을 변화시킵니다.
   3. 지질 스톡이 유리 앰플에 담겨 제공되므로 1mL 주사기를 사용하여 필요한 양의 지질을 유리 바이알에 전달합니다. 바이알에 디티오트레이톨(DTT) 2mg을 첨가하여 지질 산화를 방지합니다. 클로로포름의 증발은 지질의 농도를 변화시킬 것이므로 빠르게 작업하십시오.
   4. 남아 있는 지질을 별도의 유리 바이알로 옮기고 PFTE 격막에 끼웁니다. 바이알에 DTT 2mg을 넣고 파라필름으로 싸서 -20°C에서 보관하여 지질 산화를 방지합니다. 바이알로 옮긴 후 3개월 이내에 지질을 사용하십시오. 마커 유출로 인한 클로로포름 스톡의 잠재적 오염을 방지하려면 마커로 라벨을 붙이는 대신 원래 앰플의 스티커를 유리 바이알로 옮깁니다.
2. 매우 부드러운 질소 흐름 아래에서 클로로포름을 증발시키면서 흄 후드에서 유리 바이알을 손으로 계속 회전시켜 본질적으로 수동 로토밥 역할을 합니다. 바이알을 일정한 속도(20-40 rpm)로 손으로 돌려 지질이 계속 움직이도록 합니다. 목표는 모든 클로로포름을 증발시키고 전체 유리 바이알에 지질을 균일하게 코팅하는 것입니다.
   주의: 클로로포름은 신경독성이 있으며 이 단계는 흄 후드에서 수행해야 합니다.
   1. 질소 튜브에 새 파스퇴르 피펫을 부착합니다. 바이알 밖으로 또는 파스퇴르 피펫에 지질이 튀지 않도록 하십시오. 팁이 바이알 바닥을 향하게 하여 공기가 바닥에서 튕겨져 나와 지질을 바이알 중앙으로 밀어 올리도록 합니다. 바이알 전체에 균일하게 코팅하고 모서리나 캡에 쌓이지 않도록 합니다. 이 전체 프로세스는 약 5분이 걸립니다.
   2. 혼합물이 두꺼워져 지질의 "비드"가 되면 바이알의 각도를 변경하여 바이알 중앙으로 유도합니다. 비드가 작아지기 시작하면 질소 흐름을 약간 높여 비드를 분산시켜 바이알에서 지질이 분출되지 않도록 합니다.
3. 진공 상태에서 남아 있는 클로로포름을 제거하십시오.
   1. 유리 바이알을 가정용 진공 청소기 또는 다이어프램 진공 펌프에 1시간 동안 올려 잔류 클로로포름의 대부분을 제거합니다. 이러한 진공은 일반적으로 클로로포름을 모두 제거할 만큼 강하지 않지만 회전식 진공 청소기보다 소량의 용매를 더 잘 견딜 수 있습니다.
   2. 바이알을 강한 진공 상태(<1mTorr)에 12-16시간 동안 올려 잔류 클로로포름을 모두 제거합니다. 이 과정에서 바이알이 부딪히지 않도록 하십시오.
4. 1.25mL의 리포솜 완충액(50mM HEPES KOH pH 7.5, 15% 글리세롤, 1mM DTT)에 지질을 재현탁합니다. 25mg의 지질로 시작했는데 그 결과 20mg/mL의 농도가 되었습니다. 눈에 보이는 덩어리 없이 지질을 완전히 재현탁합니다. 바이알 모서리에 지질이 고이면 이 과정이 오래 걸릴 수 있습니다.
   1. 샘플이 유백색처럼 부드러워질 때까지 바이알을 격렬하게 소용돌이칩니다. 클로로포름 증발이 전날 밤에 제대로 이루어졌다면 이 과정은 약 5-10분이 걸린다는 것을 발견했습니다.
   2. 지질의 완전한 재현유를 보장하려면 실온에서 휠을 ~80rpm으로 3시간 동안 회전합니다. 균일한 혼합을 보장하기 위해 1시간에 한 번씩 1분 동안 볼텍싱을 위해 휠에서 바이알을 제거합니다.
5. 깨끗한 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 지질을 조심스럽게 옮깁니다. 액체 질소를 사용하여 5번의 동결-해동 주기를 수행하여 동결하고 30°C 가열 블록을 사용하여 동결합니다. 이 단계는 다층 소포를 단층 소포로 변환하는 데 도움이 됩니다.
6. 지질을 압출합니다.
   1. 동결-해동 주기 동안 미니 압출기를 준비합니다. 10mm 필터 지지대와 원하는 기공 크기(200nm 사용)의 폴리카보네이트 멤브레인으로 미니 압출기를 조립합니다. 필터의 크기는 리포좀의 크기에 영향을 미치며, 이는 재구성에 필요한 단백질의 농도에 영향을 미칩니다(2.3단계).
   2. 미니 압출기를 핫 플레이트에 놓고 압출기 온도를 최대 60°C까지 올립니다.
   3. 1mL 기밀 유리 주사기에 지질을 빨아들이고 미니 압출기의 한쪽 끝에 조심스럽게 놓습니다. 빈 기밀 주사기를 미니 압출기의 다른 쪽에 놓습니다. 지질이 5-10분 동안 압출기 스탠드 온도와 평형을 이루도록 합니다.
   4. 채워진 주사기의 플런저를 부드럽게 밀어 지질을 대체 주사기로 옮깁니다. 대체 주사기의 용액을 원래 주사기에 밀어 넣습니다. 이 앞뒤 과정을 15회 반복하여 15^번째 통과에서 지질이 대체 주사기에서 끝나도록 합니다. 각 패스의 볼륨을 모니터링하여 누수가 없는지 확인합니다.
7. 지질의 일회용 부분 표본을 준비하고 액체 질소에서 급속 동결한 후 -80 °C에서 보관합니다. 리포좀은 -80°C에서 수개월 동안 안정적입니다. 재구성에는 한 번에 10μL의 리포좀이 필요하므로(단계 2.3.4), 10μL 또는 20μL 분취액을 준비하는 것이 편리합니다.

2. Msp1 및 Model TA 단백질의 재구성

1. 재구성 완충액을 준비합니다 : 50 mM HEPES pH 7.5, 200 mM 칼륨 아세테이트, 7 mM 마그네슘 아세테이트, 2 mM DTT, 10 % 자당, 0.01 % 아지드 나트륨, 0.2-0.8 % Deoxy Big Chaps (DBC).
   1. 새로운 리포솜 배치에 대한 재구성 조건을 최적화합니다. 최적의 재구성에 필요한 DBC 및 바이오비드의 농도는 사용된 리포좀의 배치에 따라 다릅니다. 준비 간 변동성을 제한하려면 모든 실험에 동일한 로트의 DBC를 사용합니다. 많은 DBC를 변경할 때 최적화 프로세스를 반복합니다.
   2. 새로운 리포솜 배치를 준비할 때마다 DBC(0.2% - 0.8%) 및 바이오비드(25mg - 100mg)의 농도가 다른 일련의 재구성을 설정합니다. DBC를 임계 미셀 농도(CMC)인 ~0.12% 이하로 떨어뜨리지 않는 것이 중요합니다. 조건이 최적화되면 동일한 리포좀 준비 및 재구성 조건을 사용하여 모든 데이터를 수집하는 것이 좋습니다.
   3. 다양한 재구성 조건의 효과를 3단계에서 설명한 추출 분석을 사용하여 분석합니다.
2. 최종 농도 250mg/mL에서 바이오비드를 준비합니다.
   1. 건조된 바이오비드 2.7g의 무게를 측정하고 100% 메탄올(약 45mL)의 50mL 원심분리 튜브에 재현탁하여 비드를 적십니다. 처음에는 비드의 기공에 공기가 갇히는 것을 방지하기 위해 바이오 비드를 메탄올에 적십니다. 메탄올에 들어간 후에는 바이오비드에 갇힌 공기가 세제를 흡수하는 능력에 변화를 일으키므로 바이오비드를 젖은 상태로 유지하십시오.
   2. 약 45mL의 초순수(18.2mΩ)로 비드를 8x 세척하여 메탄올을 제거하며, 이하 ddH₂O. 펠렛 비드를 3,200 x g에서 1분 동안 회전시켜 메탄올을 제거합니다. 액체를 디캔팅하고 ddH₂O에 재현탁시킵니다.
   3. 세척 후 0.02% 아지드화나트륨과 함께_ddH2O10ml에 재현탁하고 4°C에서 보관합니다.바이오비드는 4°C에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다. 이 재고는 세척 단계에서 ~0.2g이 손실되는 것으로 가정되므로 250mg/mL입니다.
3. 리포좀의 크기와 리포좀당 TA 단백질 및 Msp1의 원하는 분자 수를 계산합니다. 이를 통해 재구성에 필요한 Msp1 및 TA 단백질의 농도를 측정할 수 있습니다.
   1. 먼저, 등식
      를 사용하여 단층 리포좀당 지질 분자 수(_{N total})를 계산합니다.
      여기서 d는 리포솜의 직경, h는 이중층의 두께, a는 지질 헤드그룹 영역입니다.
      1. DLS로 리포좀 직경을 측정합니다. 이 예에서는 리포좀 직경(d)에 대해 70nm의 값을 얻었습니다.
      2. h에는 5nm, a에는 0.71nm²의 값을 사용하며, 이는 포스파티딜콜린의 헤드그룹 크기입니다. 이 특정 상황에서 N개의 _합계는 37,610입니다.
   2. 다음으로, 혼합물 내 지질의 평균 분자량을 사용하여 지질 M_지질의 몰 농도를 계산합니다. 이 예에서 지질의 농도는 20mg/mL(단계 1.4)이고 지질의 평균 분자량은 810g/mol입니다(표 1). 그 결과 M_지질에 대해 0.0247M의 값이 생성됩니다.
   3. 다음으로, 방정식
      를 사용하여 리포솜 M_리포좀의 몰 농도를 계산합니다.
      여기서 M_지질은 단계 2.3.2의 지질의 몰 농도이고, N_total은 단계 2.3.1에서 계산된 리포솜당 지질의 총 수입니다. 이 예에서 리포좀의 20mg/mL 스톡 농도는 약 660nM입니다.
   4. 100 μL 재구성 반응에 필요한 Msp1 및 TA 단백질의 양을 계산합니다.
      메모: 재구성에서 지질의 최종 농도는 2mg/mL이며, 이는 리포좀 스톡의 10배 희석입니다. 이것은 66nM의 최종 리포좀 농도를 제공합니다. Msp1의 최종 농도는 792nM이며, 이는 리포좀당 평균 총 12개의 복제(2개의 기능성 헥사머)를 제공합니다. TA 단백질의 최종 농도는 660nM이며, 이는 리포솜당 평균 10개의 복제를 제공합니다.
4. PCR 튜브에서 정제된 Msp1, TA 단백질 및 리포좀을 재구성 완충액에서 함께 혼합합니다. 첨가 순서는 완충액, 단백질, 리포솜이 마지막입니다. 총 부피는 100μL입니다. 혼합물을 얼음 위에 10분 동안 그대로 둡니다. Msp1 및 TA 단백질을 정제합니다.
   1. 분석을 처음 설정할 때 잘 특성화된 모델 TA 단백질 His-Flag-Sumo-Sec22를 양성 대조군 기질로 사용합니다. 이 구조체는 간편한 정제를 위한 His-tag, 웨스턴 블롯에 의한 검출을 위한 3x-Flag 태그, 용해도 향상을 위한 Sumo domain, Msp1에 의한 재구성 및 인식을 위한 ER-TA 단백질 Sec22의 TMD를 가지고 있습니다.
   2. 단백질 정제에서 N-Dodecyl β-D-maltoside(DDM)가 재구성에 미치는 영향을 최소화하기 위해 Msp1 및 TA 단백질의 원액이 모두 약 100μM인지 확인합니다. 정제 된 Msp1은 20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM 염화나트륨, 0.1 mM Tris (2- 카르 복시 에틸) 포스 핀 염산염 (TCEP), 0.05 % DDM에있는 반면 정제 된 TA 단백질은 50 mM Tris pH 7.4, 150 mM 염화나트륨, 10 mM 염화 마그네슘, 5 mM β-메르캅토에탄올, 10 % 글리세롤, 0.1 % DDM. 약 100μM TA 단백질과 Msp1 단량체의 원액은 이러한 성분이 최종 재구성 부피의 5%< 구성하도록 보장하여 DDM을 CMC 이하로 희석합니다.
5. 세제를 제거하기 위해 샘플에 원하는 양의 바이오비드를 첨가합니다.
   1. 구슬이 팁을 통과할 수 있도록 p200 피펫 팁의 끝을 직경이 약 1/8인치로 자릅니다. 균일한 혼합물을 얻기 위해 바이오비드 튜브를 철저히 볼텍스하고 바이오비드가 가라앉기 전에 뚜껑과 피펫을 빠르게 부피를 높입니다. 바이오비드를 빈 PCR 튜브로 옮깁니다.
   2. 재구성이 얼음에서 10분 배양을 마치면 자르지 않은 피펫 팁을 사용하여 바이오비드에서 모든 액체를 제거합니다. 그런 다음 100μL 재구성을 바이오비드가 있는 튜브로 옮깁니다. 이 작업은 바이오비드가 공기를 가두어 비드가 뜨지 않도록 신속하게 수행해야 합니다.
6. 재구성이 4°C에서 16시간 동안 ~80rpm의 휠에서 회전하도록 합니다.
7. 바이오비드에서 재구성된 물질을 제거합니다. 피코푸지에서 빠르게 회전하여 바이오비드를 펠릿화한 다음 절단되지 않은 피펫 팁을 사용하여 재구성된 재료를 깨끗한 PCR 튜브로 옮깁니다. 샘플에 바이오비드가 남지 않을 때까지 이 과정을 1-2회 반복합니다. 얼음 위에서 재구성을 유지하십시오.
8. 리포솜으로 재구성되지 않은 단백질을 제거하기 위해 재구성된 물질을 미리 투명화합니다.
   1. 추출 완충액 준비: 50mM HEPES pH 7.5, 200mM 아세트산 칼륨, 7mM 마그네슘 아세테이트, 2mM DTT, 100nM 염화칼슘.
   2. glutathione spin column을 제조업체의 지시에 따라 Extraction Buffer로 평형을 이룹니다. 여기에는 일반적으로 400μL의 버퍼로 3회 세척한 다음 실온에서 2분 동안 700 x g에서 원심분리하여 버퍼를 제거하는 작업이 포함됩니다.
   3. 재구성된 재료에 각 샤페론(GST-SGTA 및 GST-Calmodulin)을 5μM씩 추가합니다. 이 샤페론은 리포솜으로 재구성되지 않은 모든 단백질의 TMD에 결합합니다. 샤프론의 정화는 앞에서 설명했습니다.
      메모: 이러한 샤페론은 상업적으로 이용 가능하지만 비용과 품질을 관리하기 위해 사내에서 정제하는 것을 선호합니다. 두 단백질 모두 20mM Tris pH 7.5, 100mM 염화나트륨 및 0.1mM TCEP에 있으며 약 160μM의 스톡 농도를 갖습니다. SGTA는 소수성이 높은 TMD를 가진 기질을 인식하는 반면 Calmodulin은 TMD를 중간 정도의 소수성으로 결합합니다. 이 샤프롱 칵테일은 함께 광범위한 기질을 인식할 수 있습니다.
   4. 재구성된 물질에 100μL의 추출 완충액을 추가하여 부피를 최대 200μL까지 높입니다. 이를 평형화된 글루타티온 스핀 컬럼에 추가합니다. 글루타티온 스핀 컬럼은 사전 세정량 부피가 200 – 400 μL일 때 가장 높은 시료 회수율을 제공합니다.
   5. 스핀 컬럼을 막고 80°C에서 ~4rpm으로 30분 동안 회전하여 샤페론이 수지에 결합할 수 있도록 합니다.
   6. 실온에서 700 x g에서 2분 동안 컬럼을 회전시킵니다. 플로우 스루는 응집된 단백질이 고갈된 사전 세척된 물질입니다. 물질을 얼음 위에 보관하고 추출 분석을 직접 진행하십시오.

3. 추출 분석

1. SDS PAGE 분석을 위한 튜브를 준비합니다. 각 반응에는 INPUT(I), FLOW THROUGH(FT), WASH(W) 및 ELUTE(E)의 4개의 튜브가 있습니다.
   1. 45μL의 ddH₂O 샘플을 INPUT 튜브에, 40μL의 ddH₂O를 FLOW THROUGH 튜브에, 0μL를 WASH 및 ELUTE 튜브에 추가합니다.
      메모: 이 분석에서 최상의 신호 대 잡음비는 WASH 및 ELUTE 샘플이 INPUT 및 FLOW THROUGH 샘플에 비해 5배 농축되어 있을 때 얻어집니다. 분석 중 희석으로 인해 INPUT 샘플의 경우 5μL의 샘플, FLOW THROUGH 샘플의 경우 10μL의 샘플, WASH 및 ELUTE 샘플의 경우 50μL의 샘플을 채취해야 합니다.
   2. 각 튜브에 16.6 μL의 4x SDS PAGE 로딩 버퍼를 추가합니다. 각 샘플의 총 부피는 SDS PAGE 로딩 버퍼 전에 50μL입니다. 최종 부피는 66.6 μL(50 μL 샘플 + 16.6 μL의 4x SDS PAGE 로딩 버퍼)입니다.
2. 추출 분석을 조립합니다.
   1. 60μL의 사전 세척된 프로테올리포좀, 5μM의 GST-SGTA, 5μM의 GST-칼모듈린 및 2mM ATP를 포함하는 추출 반응을 준비합니다. 반응을 시작하는 데 사용되는 ATP를 제외한 모든 시약을 결합합니다. Extraction Buffer.
      를 사용하여 최종 부피가 200 μL가 됩니다. 메모: 각 추출 분석에 60μL의 샘플이 사용되므로 세 가지 다른 추출 분석에 한 번의 재구성을 사용할 수 있습니다. 동일한 재구성의 재료에 대해 positive 및 negative control(+ATP 및 -ATP)을 수행합니다.
   2. 30°C 가열 블록에서 2분 동안 예열 추출 분석.
3. 최종 농도 2mM에 ATP를 추가하고 타이머를 시작하여 추출 분석을 시작합니다.
   1. 피코푸지에서 5초간 회전시켜 ATP를 반응에 혼합합니다. 30°C에서 30분 동안 반응을 배양합니다.
   2. 배양 중에 반응의 5 μL를 취하여 INPUT 튜브에 첨가합니다. 이것의 타이밍은 유연합니다.
   3. 이 배양 기간 동안 추출 분석에서 각 샘플에 대해 하나의 글루타티온 스핀 컬럼을 평형화합니다.
4. 샤페론에서 풀다운을 수행하여 추출된 재료를 분리합니다.
   1. 30분 배양이 완료되면 200μl의 추출 버퍼를 튜브에 추가하여 총 부피를 400μL로 만듭니다. 평형을 이룬 글루타티온 수지에 추가하고 4°C에서 30분 동안 휠에 결합합니다.
   2. 실온에서 700 x g로 2분 동안 컬럼을 회전시켜 흐름을 수집합니다. FLOW THROUGH 튜브에 대해 10μL를 취합니다. 이 샘플에는 여전히 지질 이중층에 통합된 기질이 포함되어 있습니다.
   3. 400μL의 추출 버퍼로 레진을 두 번 세척하여 플로우 스루를 버립니다. 세 번째 세척 시 흐름을 유지하고 WASH 튜브에 50μL를 사용합니다.
   4. 추출 완충액에서 최종 농도인 5mM에 환원된 글루타티온을 첨가하여 5mL의 용리 완충액을 준비합니다. 이 버퍼를 매번 새로 준비합니다.
   5. 스핀 컬럼에 200μL의 용리 버퍼를 추가합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다. 실온에서 700 x g로 2분간 회전하여 용리합니다. 흐름을 유지하십시오. 총 용리 부피가 400μL가 되도록 이 과정을 두 번 반복합니다.
   6. 용리 샘플에서 50μL의 샘플을 채취하여 ELUTE 튜브에 추가합니다.

의 년 분 일 분 년 의 분 님 분 분 년 명 년 월 호 분 님 의 의 월 분 분 년 분 호 호 분

지질	두더지 %	MW	평균 MW	25 mg에 있는 μmol	25 mg의 mg	염소 원료(mg/mL)	25mg의 경우 μL
개인용 컴퓨터	48%	770	369.6	14.82	11월 41	25	456.4
체육	28%	746	208.88	8.64	6.45	25	258.0
원주율	10%	902	90.2	3.09	2.78	10	278.5
DOPS	10%	810	81	3.09	2.50	10	250.1
목차	4%	1502	60.08	1.23	1.85	25	74.2
Conc. Corr 평균 MW				809.76
μmol	30.87

표 1: 리포좀 준비를 위한 샘플 계산.이 표의 주요 목표는 지질 혼합물의 농도 보정 평균 분자량과 리포좀을 만드는 데 필요한 각 지질 스톡의 부피를 계산하는 것입니다. MW 및 재고 농도는 제품 라벨에서 비롯됩니다. 지질과 몰 %는 사용자가 선택합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
바이오비즈	바이오 라드	1523920
소 간 포스파티딜 이노시톨	아반티	840042C	원주율
닭고기 달걀 포스파티딜 콜린	아반티	840051C (영문)	개인용 컴퓨터
닭고기 달걀 포스파티딜 에탄올아민	아반티	840021C (영문)	체육
필터 지원	아반티	610014
유리병(glass vial)	폭스바겐	60910L-1
글루타티온 스핀 컬럼	써모 피셔	PI16103
미니 압출기	아반티	610020
합성 1, 2- 디올레오일 -sn- 글리세로 -3- 포스포 -L- 세린	아반티	840035C	DOPS
합성 1', 3'-bis[12-dioleoyl-snglycero-3-phospho]-glycerol	아반티	710335씨	목차
주사기 1 mL	규범-젝트 53548-001
시린지 1 mL 기밀	아반티 610017