기생충에서 약물 유발 세포 독성을 평가하기 위한 β-갈락토시다아제 분석

초록

출처: Alonso, V. L. et al. 체외-갈락토시다아제를 β발현하는 기생충을 이용한 트리파노소마 크루지의 모든 수명 주기 단계에 대한 약물 스크리닝. J. Vis. Exp. (2021)

이 비디오에서는 β-갈락토시다아제 효소를 발현하는 기생충 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)에 대한 트리파노시드 약물의 세포 독성 가능성을 결정하는 간단하고 강력한 방법을 설명합니다. β-갈락토시다아제는 세포 용해 지표 역할을 하며, 그 활성은 약물의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. β-galactosidase 분석

참고: β-갈락토시다아제 활성의 정량화는 기생충의 수를 결정하는 간접적인 방법으로 사용됩니다. 트리파노시달 화합물이 존재할 경우 성장이 억제되어 처리되지 않은 대조군에 비해 기생충 수가 감소할 것으로 예상되며, 이는 β-갈락토시다아제 활성이 낮아 흡광도가 낮아지는 것으로 반영될 것입니다.

1. BZN으로 기생충을 배양하십시오.
   1. 웰당 100μL의 해당 2x 벤즈니다졸(BZN) 용액을 추가하여 80, 40, 20, 10, 5 및 2.5μM의 BZN의 최종 농도에 도달하여 100μL의 후성마스티고트, 아마스티고테스가 있는 베로 세포(감염 후 2일) 또는 96웰 플레이트의 트리포마스티고테스에 도달합니다.
   2. epimastigotes를 28°C에서 72시간 동안 배양하고, trypomastigotes 또는 감염된 Vero 세포를 37°C 및 5% CO₂.
      에서 24시간 동안 amastigotes로 배양합니다. 메모: 각 약물 농도는 최소한 3회 이상 평가되어야 하며 디메틸설폭사이드(DMSO)에 감염된 후피유양세포, 트리포마스티고테스 및 감염된 베로 세포의 대조 배양을 포함해야 합니다.
2. 비색 반응
   1. 처리 배양 기간 후, 감염된 Vero 세포 또는 트리포마스티고트가 페놀 레드로 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)에 있는 경우 간섭을 피하기 위해 배지를 100μL의 1x PBS로 교체합니다. 100 μL의 해당 배지(또는 적절한 경우 1x PBS)만 포함하는 3중 블랭크 웰을 수행합니다.
      메모: LIT 배지 또는 페놀 레드가 없는 DMEM의 경우 후피마스티고티에 대한 배양 배지를 제거할 필요가 없습니다. 페놀 레드가 있는 DMEM은 여전히 사용할 수 있습니다. DMEM만으로 블랭크 웰을 준비하여 염기 흡광도를 측정한 다음 데이터 분석 중에 이 값을 뺍니다. 무색의 Schneider의 곤충 배지는 epimastigotes의 대안입니다.
   2. 클로로페놀 레드 β-D-갈락토피라노사이드(CPRG) 기질 용액 40μL와 세제 용액 10μL를 각 웰에 첨가하여 각 웰에서 250μL의 최종 부피에서 200μM CPRG의 최종 농도와 0.1% 세제를 얻습니다.
      메모: CPRG 용액과 세제는 웰당 50μL의 최종 부피로 함께 첨가할 수 있습니다.
   3. 37°C에서 2시간 동안 배양하고 마이크로플레이트 분광 광도계에서 595nm에서 흡광도를 측정합니다.
      메모: 예상되는 색상 변화는 β-galactosidase 효소 절단 시 노란색에서 적갈색입니다(그림 1A). 배양 시간은 최대 4시간까지 연장될 수 있으며, 클로로페놀 레드의 흡광도 스펙트럼은 유사한 곡선 피팅으로 570 및 595 nm 사이에서 판독할 수 있습니다. CPRG 기질이 있는 상태에서 최대 24시간 동안 배양하면 유사한 곡선 피팅이 나타났습니다.

결과

그림 1: Dm28c 상피유양에 대한 벤즈니다졸의 IC50 값 계산. (A) CPRG를 추가하기 전(1), CPRG 및 세제를 처음 첨가한 후(2), CPRG 및 세제로 배양 후(3)를 보여주는 다양한 BZN 농도(2.5, 5, 10, 20, 40 및 80μM)로 처리된 후피마스티고트가 있는 96웰 플레이트. (B) Dm28c/pLacZ 유성 유막 접합체에 대한 595nm에서 BZN 대 흡광도(OD)의 대수 농도의 XY 플롯. 플롯은 IC50 값을 추정하기 위해 비선형 회귀를 사용하여 적합되었습니다. 각 값은 6개의 독립적인 생물학적 복제의 평균과 표준 편차(오차 막대)를 나타냅니다. 연속적인 파란색 선은 곡선 맞춤을 나타냅니다. 약어: CPRG = 클로로페놀...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96웰 플레이트	코 닝	3599
벤즈니다졸	시그마 알드리치	419656
5 mL 혈청학적 피펫 멸균	제트 바이오필	GSP010005
10 mL 혈청학적 피펫 멸균	제트 바이오필	GSP211010
생물안전성 캐비닛	텔스타	바이오 II A/P
심폐소생술(CPRG)	로슈	10 884308001	클로로페놀 레드-β-D-갈락토피라노시드
DMEM, 고혈당	써모 피셔 Cientific	12100046	가루
디엠소	신토간	SIN-061	디메틸설폭사이드
태아 송아지 세럼	Internegocios SA	FCS 재질 보기 FRA 500	멸균 및 열 비활성화
베로 세포	증권 시세	CRL-1587
마이크로플레이트 분광 광도계	(주)바이오텍	시너지 HTX
마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mL	타슨	500010-N
G418 이황산염 염 용액	로슈	G418-RO	재고 농도: 50mg/mL

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