테스트 약물 노출 시 뇌 절편에서 모노아민 방출을 측정하기 위한 플레이트 기반 분석

초록

출처: Pino, J. A. et al. 급성 뇌 절편에서 내인성 모노아민 방출을 측정하기 위한 플레이트 기반 분석법입니다. J. Vis. 특급 (2021년)

이 비디오에서는 시험 약물로 치료할 때 대사가 활성화된 생체 외 쥐 뇌 절편의 뉴런에서 모노아민 방출 메커니즘을 조사하는 분석을 보여줍니다. 이 분석은 신경자극제는 세포 모노아민 수송체를 통해 모노아민 방출을 유도하는 반면, 높은 KCl 농도는 시냅스 소포 외세포작용 매개 소포 모노아민 방출을 유도한다는 것을 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 뇌 절편 또는 펀치에서 생체 외 내인성 모노아민 방출

참고: 이 섹션에 사용된 장치는 48웰 플레이트와 탄화 라인에 연결된 삽입 필터가 없는 6개의 마이크로 원심분리기 필터 장치로 만들어진 티슈 홀더로 구성됩니다(그림 1). 홀더를 만들려면 튼튼한 플라스틱 막대(예: 셀 스크레이퍼)를 사용하고 삽입 필터가 없는 미세 원심분리기 필터 장치를 강력하게 접착합니다. 1-2일 동안 말리십시오. 내인성 모노아민 방출 실험에 필요한 시간과 암페타민, 플루옥세틴 및 코카인의 농도는 현재 문헌 및 이전 프로토콜을 기반으로 합니다.

1. 조직 활성화
   1. 뇌 조직을 유출 챔버의 각 웰로 옮기고 30-50 °C에서 0.5-1 mL의 산소 유출 완충액에 있는 슬라이드 워머에서 지속적이고 부드러운 거품과 함께 회복을 허용합니다(그림 1B1).
   2. 이 배양 중에 약물을 실험에 필요한 원하는 농도로 희석합니다. 모든 약물은 유출 완충액에 용해되어야 하며, 농도는 현재 문헌을 기반으로 합니다.
2. 첫 번째 배양
   1. 뇌 조직이 있는 조직 홀더를 500μL의 산소가 함유된 유출 완충액이 들어 있는 웰로 옮기고 37°C에서 20분 동안 배양합니다. 홀더에 여분의 버퍼가 없을 때까지 웰 가장자리의 홀더를 두드려 버퍼가 최소한으로 또는 전혀 운반되지 않도록 합니다.
   2. 모노아민 수송체 억제제와 같은 약리학적 제제를 사용한 실험에서 산소가 함유된 유출 완충액(예: 10μM 플루옥세틴, 40μM 코카인, 그림 1B2 참조)에 희석된 약물로 조직 샘플을 배양합니다. 각 웰의 최종 부피는 500μL입니다.
3. 두 번째 배양
   1. 조직이 있는 홀더를 각 약물의 원하는 농도 유무에 관계없이 500μL의 총 유출 완충액을 포함하는 새로운 웰 세트로 이동합니다. 여분의 버퍼가 남아 있지 않은지 확인합니다. 각 웰은 실험 조건에 대한 n= 1을 나타냅니다. 각 실험 조건은 세 번으로 수행됩니다.
   2. 하나의 웰에는 산소화된 유출 완충액이 포함되고, 다음 웰에는 10-30μM AMPH가 포함되며, 마지막 웰에는 10-30μM AMPH와 모노아민 수송 억제제가 포함됩니다. 각 약물은 산소가 함유된 유출 완충액에 용해됩니다.
   3. 약물 condition .
      의 500μL로 37°C에서 20분 동안 조직을 배양합니다. 메모: 추가 웰에는 모노아민 수송체 억제제가 있거나 없는 산소화된 높은 K+ 유출 완충액이 포함될 수 있습니다. 산소가 공급된 유출 완충액(500μL)에 각 약물을 용해시킵니다.
   4. 20분의 두 번째 배양 동안 1.2.1단계의 첫 번째 배양에서 웰에서 용액을 수집하고 50μL의 1N 과염소산 또는 인산(HPLC 유형에 따라 다름, 최종 농도 0.1N)을 포함하는 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 샘플의 최종 부피는 550μL입니다. 얼음 위에 마이크로 원심분리기 튜브를 유지하고 튜브에 #1에 라벨을 붙입니다.
   5. 20분의 두 번째 배양 후 뇌 절편이나 펀치가 있는 조직 홀더를 빈 우물로 옮기고 플레이트를 얼음 위에 유지합니다. 상층액을 50μL의 1N 과염소산 또는 인산이 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 샘플의 최종 부피는 550μL입니다. 얼음 위에 미세 원심분리기 튜브를 유지하고 튜브 #2에 라벨을 붙입니다.
   6. 1mL의 얼음처럼 차가운 해부 완충액을 각 웰이 들어있는 조직에 추가합니다. 작은 핀셋을 사용하여 모든 조직을 수집하고 깨끗한 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
   7. 뇌 조직이 있는 튜브를 -80°C로 유지합니다.1mL의 박리 완충액을 폐기합니다(그림 1B4).
   8. 2,500 x g에서 2분 동안 마이크로 원심분리기 필터 튜브(0.22μm)를 사용하여 각 배양에서 얻은 필터 용액. 여과액을 사용하여 전기화학적 검출과 함께 HPLC를 사용하여 모노아민 함량을 측정합니다(그림 1B5).

결과

그림 1: 유출 실험을 위한 실험 설정. (A) 유출 챔버는 48웰 조직 배양 플레이트와 카보겐 라인에 연결된 조직 홀더 트레이로 구성됩니다. (B) 조직 활성화(B1), 모노아민 수송체 억제제의 유무에 따른 사전 배양(B2), 유출 실험(B3) 및 최종 시료 처리(B4-B5)가 제시된 내인성 모노아민 유출 실험의 실험 설계를 보여주는 다이어그램. (C) 왼쪽 패널은 자동 주입을 준비하기 위해 HPLC에 관류액을 적재하는 실험자를 묘사합니다. 오른쪽 패널은 모노아민 표준물질 피크를 나타내는 대표적인 크로마토그램을 보여줍니다. AUC(Area Under the Curve)...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
48웰 플레이트	해당 없음	해당 없음	시험
염화칼슘 무수	시그마 알드리치	C1016	변형된 인공 뇌척수액 또는 유출 완충액
D-(+)-포도당	시그마	1002608421	해부 버퍼
L-아스코르브산	시그마 알드리치	A5960	해부 버퍼
마그네슘 황산염	시그마	7487-88-9	KH 버퍼
마이크로 원심분리기 필터 유닛 UltraFree	밀리포어	C7554	분석 - 48웰 플레이트에 맞는 6
Pargyline 클로로하이드레이트	시그마 알드리치	P8013	변형된 인공 뇌척수액 또는 유출 완충액
염화칼륨	시그마	12636	KH 버퍼
인산칼륨 일염기성	시그마	1001655559	KH 버퍼
중탄산나트륨	시그마	S5761	해부 버퍼
중탄산나트륨	시그마 알드리치	S5761	해부 버퍼
소금	시그마	S3014	KH 버퍼

개 년