테스트 약물 노출 시 뇌 절편에서 모노아민 방출을 측정하기 위한 플레이트 기반 분석

초록

출처: Pino, J. A. et al. 급성 뇌 절편에서 내인성 모노아민 방출을 측정하기 위한 플레이트 기반 분석법입니다. J. Vis. 특급 (2021년)

이 비디오에서는 시험 약물로 치료할 때 대사가 활성화된 생체 외 쥐 뇌 절편의 뉴런에서 모노아민 방출 메커니즘을 조사하는 분석을 보여줍니다. 이 분석은 신경자극제는 세포 모노아민 수송체를 통해 모노아민 방출을 유도하는 반면, 높은 KCl 농도는 시냅스 소포 외세포작용 매개 소포 모노아민 방출을 유도한다는 것을 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 뇌 절편 또는 펀치에서 생체 외 내인성 모노아민 방출

참고: 이 섹션에 사용된 장치는 48웰 플레이트와 탄화 라인에 연결된 삽입 필터가 없는 6개의 마이크로 원심분리기 필터 장치로 만들어진 티슈 홀더로 구성됩니다(그림 1). 홀더를 만들려면 튼튼한 플라스틱 막대(예: 셀 스크레이퍼)를 사용하고 삽입 필터가 없는 미세 원심분리기 필터 장치를 강력하게 접착합니다. 1-2일 동안 말리십시오. 내인성 모노아민 방출 실험에 필요한 시간과 암페타민, 플루옥세틴 및 코카인의 농도는 현재 문헌 및 이전 프로토콜을 기반으로 합니다.

1. 조직 활성화
   1. 뇌 조직을 유출 챔버의 각 웰로 옮기고 30-50 °C에서 0.5-1 mL의 산소 유출 완충액에 있는 슬라이드 워머에서 지속적이고 부드러운 거품과 함께 회복을 허용합니다(그림 1B1).
   2. 이 배양 중에 약물을 실험에 필요한 원하는 농도로 희석합니다. 모든 약물은 유출 완충액에 용해되어야 하며, 농도는 현재....

결과

그림 1: 유출 실험을 위한 실험 설정. (A) 유출 챔버는 48웰 조직 배양 플레이트와 카보겐 라인에 연결된 조직 홀더 트레이로 구성됩니다. (B) 조직 활성화(B1), 모노아민 수송체 억제제의 유무에 따른 사전 배양(B2), 유출 실험(B3) 및 최종 시료 처리(B4-B5)가 제시된 내인성 모노아민 유출 실험의 실험 설계를 보여주는 다이어그램. (C) 왼쪽 패널은 자동 주입을 준비하기 위해 HPLC에 관류액을 적재하는 실험자를 묘사합니다. 오른쪽 패널은 모노아민 표준물질 피크를 나타내는 대표적인 크로마토그램을 보여줍니다. AUC(Area Under the Curve).......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
48웰 플레이트	해당 없음	해당 없음	시험
염화칼슘 무수	시그마 알드리치	C1016	변형된 인공 뇌척수액 또는 유출 완충액
D-(+)-포도당	시그마	1002608421	해부 버퍼
L-아스코르브산	시그마 알드리치	A5960	해부 버퍼
마그네슘 황산염	시그마	7487-88-9	KH 버퍼
마이크로 원심분리기 필터 유닛 UltraFree	밀리포어	C7554	분석 - 48웰 플레이트에 맞는 6
Pargyline 클로로하이드레이트	시그마 알드리치	P8013	변형된 인공 뇌척수액 또는 유출 완충액
염화칼륨	시그마	12636	KH 버퍼
인산칼륨 일염기성	시그마	1001655559	KH 버퍼
중탄산나트륨	시그마	S5761	해부 버퍼
중탄산나트륨	시그마 알드리치	S5761	해부 버퍼
소금	시그마	S3014	KH 버퍼

개 년