대동맥 판막 간질 세포의 칼슘 농도를 측정하기 위한 석회화 분석

초록

출처: Bouchareb, R. et al., Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve in Vitro.J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 in vitro에서 대동맥 판막 간질 세포의 석회화를 평가하기 위한 분석 기술을 보여줍니다. 이 분석은 칼슘 이온과 반응하여 자주색 칼슘-비소 복합체를 형성하는 칼슘에 민감한 염료인 arsenazo III 시약을 사용하여 칼슘 농도를 정량화하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 동물 절차는 마운트 시나이 기관 핵심 및 사용 위원회의 아이칸 의과대학의 승인을 받았습니다.

1. 성체 마우스에서 판막 세포를 분리하기 전의 준비

1. 그림 1A에 표시된 모든 수술 기구를 70% v/v 에탄올을 사용하여 세척 및 멸균한 다음 30분 동안 고압멸균하고 70% 에탄올로 수술 공간을 청소합니다.
2. 500μL의 페니실린-스트렙토마이신을 10mm HEPE 50mL에 첨가합니다. 50mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)의 부분 표본을 준비합니다. 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
3. 1mg/mL 및 4.5mg/mL 콜라겐분해효소 용액을 준비하고 15mL 튜브에 각 용액 5mL를 사용하여 전체 절차를 수행합니다. 1mg/mL 콜라겐분해효소 5mL를 준비하려면 콜라겐분해효소 5mg을 Dulbecco의 Modified Eagle Medium(DMEM, 소 태아 혈청(FBS) 없음) 2.5mL 및 항생제가 보충된 10mM HEPES 2.5mL(1.2단계의 페니실린-스트렙토마이신 1%)와 혼합합니다. 0.22μm 필터를 통해 용액을 여과하여 오염물을 제거합니다.
   알림: 효소를 보호하기 위해 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
4. 아래 설명된 모든 단계에서 사용하기 전에 DMEM 용액을 37°C로 예열합니다. DMEM에 페니실린-스트렙토마이신 1%, 피루브산 나트륨 1%, 200mM L-글루타민 5mL, 마이코플라즈마 제거 시약 1mL(재료 표 참조) 및 10% FBS를 보충하여 완전한 배지를 준비합니다.

2. 밸브 셀의 격리

1. 실험을 위해 10⁵ 개의 세포를 얻으려면 8 주 된 마우스 5 마리 (최소 3 개)를 사용하십시오. 1mL의 이소플루란을 적신 작은 티슈 조각과 함께 마우스를 유도 챔버에 넣되 조직과의 접촉은 허용하지 않습니다. 동물이 완전히 마취되었는지 확인하기 위해; 발가락 핀치 반사를 확인한 다음 경추 탈구로 마우스를 안락사시킵니다. 경추 탈구 전에 통증을 완화하기 위해 이소플루란을 사용하십시오. 아래에 설명된 절차는 말기이므로 사용하십시오.
2. 해부 플랫폼에 마우스를 놓고 캐뉼러로 발을 고정하여 제자리에 고정합니다. 에탄올로 가슴과 복부를 청소하십시오. 복부와 가슴을 가위로 엽니다. 작은 수술용 가위로 좌심방과 좌심실 사이를 잘라 쥐를 출혈시킵니다. 차가운 1x PBS 10mL로 심장을 관류하여 심장에서 혈액을 제거합니다.
3. 심장을 절단하고 그림 1B와 같이 상행 대동맥에서 3mm 떨어진 곳에 있습니다. 실체현미경으로 대동맥 판막을 절개합니다. 심실 중앙에서 심장을 수평으로 자릅니다(그림 1C). 좌심실을 대동맥 쪽으로 자르고 대동맥 판막을 조심스럽게 절개합니다(그림 1D-F). 35mm의 작은 조직 배양 접시에 밸브를 함께 모읍니다.
4. 항생제(1% 페니실린-스트렙토마이신) 5mL를 첨가한 75mm 세포 배양 접시에 분리된 판막을 세척하여 혈액을 제거합니다(그림 2). 1.3.br />단계에서 위에서 설명한 대로 콜라겐분해효소 1mg/mL 및 4.5mg/mL의 15mL 튜브 2개를 준비합니다< 메모: 해부 후 멸균 생물 안전 후드에서 분리된 밸브를 조작하여 오염을 최소화합니다.
5. 콜라겐 분해 효소 유형 I (1 mg/mL)의 밸브를 30°C에서 37분 동안 지속적으로 흔들어 배양합니다(그림 2). 튜브를 150 × g에서 5 분 동안 원심 분리하고 펠릿을 2mL의 HEPES(10mM)로 한 번 세척한 다음 고속으로 30초 동안 와류를 사용합니다. 이 튜브의 내용물을 35mm 배양 접시에 붓고 얇은 핀셋을 사용하여 조직 조각을 새 튜브에 조심스럽게 옮깁니다.
   메모: 이 단계에서 VIC는 여전히 조직에서 해리되지 않았으며 펠릿에는 조직 조각이 포함되어 있습니다. 내피 세포의 오염을 방지하려면 2.5단계에서 볼텍싱 후 원심분리하지 마십시오.
6. 35분 동안 연속 교반하에서 37°C에서 5mL의 콜라겐분해효소 I형(4.5mg/mL)이 있는 15mL 튜브에 펠릿을 배양합니다. 1mL 피펫으로 세포를 다시 현탁시켜 세포를 분리하고 4°C에서 5분 동안 150×g으로 원심분리합니다.
7. 상등액을 버리고 완전한 DMEM 2mL에 펠렛을 다시 현탁시킵니다. 150 × g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기. 이 단계를 두 번 반복하여 세포를 청소합니다.
   메모: 펠릿에는 여전히 약간의 조직 조각이 있습니다.
8. 펠릿을 1mL의 완전한 배지에 다시 현탁시키고 6웰 세포 배양 접시의 한 웰에 세포를 플레이트하여 배양 접시에 쉽게 부착할 수 있도록 합니다. 세포를 5% 이산화탄소가 함유된 37°C 인큐베이터에 그대로 두십시오.
9. 3일 후 현미경으로 세포를 확인하여 조직 파편 가까이에서 잘 자랐는지 확인합니다. 현미경으로 1,000개의 세포가 보이면 오토클레이브 핀셋으로 조직 파편을 조심스럽게 제거하고 배지를 변경합니다.
   메모: 접시를 방해해서는 안 됩니다. 필요한 세포 수가 관찰되지 않으면 세포 배양 접시를 인큐베이터에 다시 2일 동안 넣습니다.
10. 세포가 70% 융합되면(2.5 × 10⁵) 트립신화한 다음 75mm 조직 배양 접시로 옮깁니다.

3. 체외 석회화 분석

1. 70% 에탄올로 후드를 청소하고 DMEM 매체를 37°C로 예열합니다.
2. 100,000개의 세포/컨디셔닝을 완전한 DMEM의 6웰 플레이트에 시딩하고 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.
3. DMEM에서 2mM의 NaH₂PO₄, 10-7M 인슐린 및 50 μg / mL 아스코르브 산을 5 % FBS와 혼합하여 석회화 매체를 준비합니다. DMEM 93mL의 경우 FBS 5mL, 항생제 1mL(최종 농도 1%), 피루브산 나트륨 1mL(100mM), NaH₂PO₄ 27.5mg 27.5mg, 인슐린 5.8μL 및 아스코르브산 5mg을 추가합니다.
   알림: 사용하기 전에 0.22μm 필터를 사용하여 용액을 필터링하십시오.
4. 24시간 후 상층 매체를 석회화 매체로 교체하십시오. 37°C에서 7일 동안 세포를 배양합니다. 3일째에는 새로운 석회화 매체로 교체하고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣어 7일간의 치료를 완료합니다.
5. 7일 후 배지를 제거하고 1x PBS 2mL로 세포를 두 번 세척합니다. 37°C에서 24시간 동안 0.6N 염산(HCl) 1mL에 세포를 배양합니다. 1.5mL 튜브에 HCl을 수집하고 회전 증발기에서 증발시킵니다. 모든 튜브의 내용물을 60μL의 HCl.
   에 다시 현탁합니다. 메모: 건조 절차는 용액을 농축하고 각 조건에 대해 동일한 부피를 갖는 것이 중요합니다.
6. 96웰 플레이트를 사용하여 바로 사용할 수 있는 키트에 포함된 Arsenazo III 시약을 사용하여 칼슘 농도를 측정합니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
7. 10mg/dL 농도의 칼슘 표준 용액을 준비합니다. 수산화칼슘(Ca(OH)₂) 10mg의 무게를 달아 증류수 100mL에 녹입니다.
8. 투명한 96웰 플레이트에서 2μL의 블랭크 용액(HCl, 0.6N), 표준 용액, 웰당 샘플(10mg/dL) 및 샘플을 피펫으로 만듭니다. 피펫팅 변동성을 검증하기 위해 실험을 세 번 수행합니다. 각 조건에 대해 200μL의 시약을 추가합니다.
   메모: 15mg/dL 이상의 샘플은 식염수로 1:1로 희석하고 다시 분석한 다음 결과에 2를 곱해야 합니다.
9. 실온에서 15분 동안 반응을 배양합니다.
   메모: 반응은 60분 동안 안정적입니다.
10. 650nm에서 플레이트의 흡광도를 읽고 기록합니다. 다음 공식을 사용하여 샘플의 칼슘 양을 계산하십시오.
    칼슘(mg/mL) = (시료의 흡광도/표준물질의 흡광도) × 표준물질의 농도

결과

그림 1: 판막 절제에 대한 설명. (A) 해부에 필요한 모든 수술 기구의 대표 이미지로, 가위(2)는 마우스의 피부를 열어야 하고 가위(3)는 흉부를 열어야 합니다. 핀셋 5와 6은 피부를 잡고 가슴을 여는 데 필요합니다. (B) 대동맥에서 3mm의 조직을 남깁니다(검은색 화살표). (C) 4번 가위로 심실 중앙의 심장을 자릅니다. (D) 가위로 심장을 대동맥 판막 쪽으로 엽니다 3. 얇은 핀셋 7과 8을 사용하여 대동맥 판막을 조심스럽게 절개합니다. 판막이 보이며 생쥐 판막 조직의 특징인 검은색 점(파란색 화살표)이 있습니다. (E) 대동맥 판막을 더 잘 시각화하기 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3mm 절삭 날 가위	F.S.T	15000-00
Arsenazo-III 시약 세트	포인트 사이언티픽	C7529-500	칼슘 농도를 측정하는 키트
본 가위	F.S.T	14184-09
수산화칼슘	시그마 -알드리치	31219
콜라겐분해효소 I형(125단위/mg)	써모피셔 사이언티픽	17018029
DMEM을 참조하십시오.	써모피셔	11965092
매우 미세한 graefe 집게	F.S.T	11150-10
FBS(증권 시세	지브코	16000044
가는 집게	F.S.T 뒤몽
염산(HCl)	시그마-알드리치	H1758 (영문
HEPES 1M 솔루션	스템셀 기술
L-글루타민 100x	써모피셔 사이언티픽	A2916801
PBS 10배	시그마-알드리치
페니실린 스트렙토마이신 100x	써모피셔 사이언티픽	10378016
나트륨 피루브산 100 mM	써모피셔 사이언티픽	11360070
표준 패턴 겸자	F.S.T	11000-12
수술용 가위 - 샤프-블런트	F.S.T	14008-14
트립신 0.05%	써모피셔 사이언티픽	25300054

년 년 년 표시기 ) 년 년