대동맥 판막 간질 세포의 칼슘 농도를 측정하기 위한 석회화 분석

초록

출처: Bouchareb, R. et al., Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve in Vitro.J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 in vitro에서 대동맥 판막 간질 세포의 석회화를 평가하기 위한 분석 기술을 보여줍니다. 이 분석은 칼슘 이온과 반응하여 자주색 칼슘-비소 복합체를 형성하는 칼슘에 민감한 염료인 arsenazo III 시약을 사용하여 칼슘 농도를 정량화하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 동물 절차는 마운트 시나이 기관 핵심 및 사용 위원회의 아이칸 의과대학의 승인을 받았습니다.

1. 성체 마우스에서 판막 세포를 분리하기 전의 준비

1. 그림 1A에 표시된 모든 수술 기구를 70% v/v 에탄올을 사용하여 세척 및 멸균한 다음 30분 동안 고압멸균하고 70% 에탄올로 수술 공간을 청소합니다.
2. 500μL의 페니실린-스트렙토마이신을 10mm HEPE 50mL에 첨가합니다. 50mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)의 부분 표본을 준비합니다. 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
3. 1mg/mL 및 4.5mg/mL 콜라겐분해효소 용액을 준비하고 15mL 튜브에 각 용액 5mL를 사용하여 전체 절차를 수행합니다. 1mg/mL 콜라겐분해효소 5mL를 준비하려면 콜라겐분해효소 5mg을 Dulbecco의 Modified Eagle Medium(DMEM, 소 태아 혈청(FBS) 없음) 2.5mL 및 항생제가 보충된 10mM HEPES 2.5mL(1.2단계의 페니실린-스트렙토마이신 1%)와 혼합합니다. 0.22μm 필터를 통해 용액을 여과하여 오염물을 제거합니다.
   알림:

결과

그림 1: 판막 절제에 대한 설명. (A) 해부에 필요한 모든 수술 기구의 대표 이미지로, 가위(2)는 마우스의 피부를 열어야 하고 가위(3)는 흉부를 열어야 합니다. 핀셋 5와 6은 피부를 잡고 가슴을 여는 데 필요합니다. (B) 대동맥에서 3mm의 조직을 남깁니다(검은색 화살표). (C) 4번 가위로 심실 중앙의 심장을 자릅니다. (D) 가위로 심장을 대동맥 판막 쪽으로 엽니다 3. 얇은 핀셋 7과 8을 사용하여 대동맥 판막을 조심스럽게 절개합니다. 판막이 보이며 생쥐 판막 조직의 특징인 검은색 점(파란색 화살표)이 있습니다. (E) 대동맥 판막을 더 잘 시각화하기 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3mm 절삭 날 가위	F.S.T	15000-00
Arsenazo-III 시약 세트	포인트 사이언티픽	C7529-500	칼슘 농도를 측정하는 키트
본 가위	F.S.T	14184-09
수산화칼슘	시그마 -알드리치	31219
콜라겐분해효소 I형(125단위/mg)	써모피셔 사이언티픽	17018029
DMEM을 참조하십시오.	써모피셔	11965092
매우 미세한 graefe 집게	F.S.T	11150-10
FBS(증권 시세	지브코	16000044
가는 집게	F.S.T 뒤몽
염산(HCl)	시그마-알드리치	H1758 (영문
HEPES 1M 솔루션	스템셀 기술
L-글루타민 100x	써모피셔 사이언티픽	A2916801
PBS 10배	시그마-알드리치
페니실린 스트렙토마이신 100x	써모피셔 사이언티픽	10378016
나트륨 피루브산 100 mM	써모피셔 사이언티픽	11360070
표준 패턴 겸자	F.S.T	11000-12
수술용 가위 - 샤프-블런트	F.S.T	14008-14
트립신 0.05%	써모피셔 사이언티픽	25300054

년 년 년 표시기 ) 년 년