어류 배아에서 PM2.5 매개 DNA 손상을 검출하기 위한 면역형광 분석

초록

출처: Huang, Y., et al. 제브라피시 배아 심장에서 PM_2.5 유도 DNA 손상을 감지하기 위해 면역형광을 사용합니다. J. Vis. 특급 (2021).

이 동영상은 DNA 손상과 이중 가닥 DNA 절단을 각각 나타내는 8-OHdG 및 γH2AX의 수치를 측정하여 제브라피시 배아의 심장에서 PM_2.5로 인한 산화 손상을 감지하는 고감도 면역형광 기반 분석을 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. PM_2.5 샘플링 및 유기 화합물 추출

참고: PM_2.5는 앞서 설명한 대로 2015년 8월 1일부터 7일까지 중국 쑤저우의 한 도시 지역에서 수집되었습니다.

1. 47mm 석영 멤브레인 필터를 500°C 머플 퍼니스에서 2시간 동안 굽고 유기 성분을 제거합니다.
2. 24시간 동안 중단 없는 샘플링을 위해 PM_2.5 샘플러에 필터를 넣습니다.
3. 필터를 제거하고 실온에서 24시간 동안 건조합니다.
4. 분석 저울로 필터를 정량화합니다.
5. 디클로로메탄을 용매로 사용하여 Soxhlet 추출을 통해 필터에서 유기 성분을 추출합니다.
6. 60°C 수조와 질소 흐름에서 회전 증발로 EOM을 건조합니다. DMSO에 EOM을 용해하고 -20 °C에서 보관하십시오.

2. 제브라피시 배아 채취 및 치료

1. 제브라피쉬를 14시간 광주기 주기와 10시간 어두운 광주기 주기± 가진 재순환 양식 시스템에서 28.5 0.5°C로 유지합니다.
2. 건강한 성인 제브라피시를 수컷 대 암컷 비율로 2:1로 수조에 넣습니다.
3. 다음 날, 배아를 채취하여 시스템 물(즉, 제브라피쉬 번식수)로 씻습니다.
4. 정상적인 발달(균일한 크기, 완전한 곡물, 계란 응고 없음)을 보여주는 제브라피시 배아를 선택하여 직경 7cm(접시당 약 50개의 배아)의 개별 유리 페트리 접시에서 4개 그룹으로 무작위로 나눕니다.
5. 2 hpf에서 72 hpf까지 0.25 μM에서 NAC의 유무에 관계없이 배아를 PM_2.5 (5 mg/L)로 처리합니다. DMSO를 0.1%(v/v)의 최종 농도까지 차량 제어로 사용합니다.

3. 제브라피시 배아 및 심장 박리의 형태학적 관찰

1. 72hpf에서 배아를 유리 슬라이드로 옮기고 실체 현미경으로 관찰합니다. 심낭 부종, 고리 모양 변화, 크기 감소와 같은 심장 기형을 기록합니다.
2. 기형률(전체 살아있는 배아 중 심장 결함이 있는 배아의 비율)을 계산하고 일원 분산 분석에 이어 터키의 다중 비교 테스트(p < 0.05 = 통계적으로 유의함)를 사용하여 그룹 간의 차이를 분석합니다.
3. 0.6mg/mL MS-222로 배아를 마취하여 유리 슬라이드에 고정시킵니다.
4. 30초 동안 심장 박동을 기록하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 심박수를 정량화합니다.
5. 실체 현미경으로 일회용 주사기 바늘로 제브라피시 배아의 심장을 해부합니다. 주의: 하트 모양을 손상시키지 마십시오.

4. 면역형광 분석

1. 면역형광 분석을 사용하여 제브라피시 배아의 심장에서 PM_2.5로 인한 DNA 손상을 감지하려면 소수성 장벽 펜을 사용하여 깨끗한 유리 면에 원을 그립니다.
2. 50μL의 4% 파라포름알데히드를 1.25mL의 PBS(Phosphate Buffered Saline)에 첨가하여 고착 용액을 만듭니다.
3. 절개된 심장 3개를 하나의 소수성 장벽 펜 서클에 넣고 실온에서 20분 동안 배양합니다.
4. 현미경으로 용액을 디캔팅하고 샘플을 실온에서 최소 5분 동안 건조시켜 심장이 유리 슬라이드에 완전히 부착되도록 합니다.
5. 0.1% Tween 20(PBST)으로 PBS에서 슬라이드를 3회 세척하여 1회당 5분씩 세척합니다.
6. 1000μL의 PBST에 50μL의 소 혈청 알부민(BSA)을 첨가하여 5% BSA 용액을 얻고 습한 챔버에서 1시간 동안 슬라이드를 배양하여 비특이적 항체 결합을 차단합니다.
7. 용액을 디캔팅하고 세척당 5분 동안 PBST로 샘플을 세 번 세척합니다.
8. 8-OHdG에 대한 마우스 단클론 항체 2μL와 γH2AX에 대한 토끼 다클론 항체 2μL를 296μL의 PBST에 희석하여 작동하는 1차 항체 칵테일 용액을 얻습니다.
9. 가습된 챔버에서 8-OHdG 및 γH2AX에 대한 1차 항체 칵테일 용액 50μL로 심장 샘플을 실온에서 최소 1시간 동안 또는 4°C에서 밤새 배양합니다(야간 배양은 신호 강도를 증가시킬 수 있음).
10. 용액을 디캔팅하고 세척당 5분 동안 PBST로 샘플을 세 번 세척합니다.
11. FITC 표지된 염소 항 마우스 2차 항체 1 μL와 cy3 염소 항 토끼 2차 항체 1 μL를 498 μL의 PBST에 희석하여 작동하는 2차 항체 칵테일 용액을 얻고 2차 항체(PBST에서 1:500)로 샘플을 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
12. 용액을 디캔팅하고 빛으로부터 보호된 세척당 5분 동안 PBS로 샘플을 세 번 세척합니다.
13. 실온에서 30분 동안 핵 염색을 위해 샘플에 20μL의 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 추가합니다.
14. 커버슬립을 밀어 붙이고 매니큐어로 밀봉하여 건조와 움직임을 방지합니다. 그런 다음 형광 현미경으로 샘플을 이미지화하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 심장 부위의 형광 신호를 정량화합니다. DMSO 대조군 샘플의 평균을 사용하여 상대적 변화를 계산합니다. 3.2단계에서와 같이 데이터의 통계적 유의성을 확인합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
8-OHdG 항체	산타크루즈 생명공학, 미국	사우스캐롤라이나-66036	1차 항체
분석 저울	Sartorius, 중국	BSA124S
증권 시세	Solarbio, 베이징, 중국	SW3015	차단용
다피	Abcam, 미국	AB104139	핵 counterstain을 위해.
디엠소	Solarbio, 베이징, 중국	D8371
형광 현미경	올림푸스, 일본	익스73	형광 신호 이미징용
염소 안티 토끼 IgG Cy3	칼즈배드, 미국	CW0159	2차 항체
염소 안티 토끼 IgG FITC	칼즈배드, 미국	RS0003	2차 항체
N-아세틸-L-시스테인(NAC)	Adamas-Beta, 중국 상하이	616-91-1
오비탈 쉐이커	QILINBEIER, 중국	TS-1
파라포름알데히드	시그마, 중국	P6148	고정을 위해 4%의 파라포름알데히드를 만듭니다.
인산염 완충 식염수	HyClone, 미국	SH30256.01	세탁을 위해 PBS에 0.1% 트윈을 준비합니다.
PM2.5 샘플러	TianHong, 우한, 중국	토륨-150C	24시간 중단 없는 PM2.5 샘플링용.
재순환 양식 시스템	HaiSheng, 상하이, 중국		제브라 피쉬는 그 안에서 유지되었습니다.
Soxhlet 추출기	ZhengQiao, 상하이, 중국	BSXT-02	유기 성분 추출용.
실체현미경	니콘, 캐나다	SMZ645	제브라피시 배아의 심장 박리용.
트리카인 메탄설포네이트(MS222)	시그마, 중국	E10521	제브라피시 배아를 마취하기 위해
트윈 20	시그마, 중국	P1379
γH2AX 항체	Abcam, 미국	AB26350	1차 항체

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