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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. rhinal cortex-hippocampus slices의 준비
참고: rhinal cortex-hippocampus slices의 준비는 P6-7 Sprague-Dawley 쥐를 사용합니다.
- 배양 설정 및 배지 준비
- 배양 전날에 필요한 배지를 준비하고 4°C에 놓습니다.
- 해부 매체 준비: Gey's Balanced Salt Solution(GBSS)에서 25mM 포도당.
- 배양 배지 준비: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% 말 혈청(HS), 25mM 포도당, 30μg/mL 겐타마이신.
- 유지 관리 매체 준비: Neurobasal-A(NBA), 2% B27, 1mM L-글루타민, 30μg/mL 겐타마이신, HS(15%, 10%, 5% 및 0%).
- 두뇌 수확
- 배양을 시작하기 직전에 P1000 피펫을 사용하여 6웰 플레이트의 각 웰에 1.1mL의 배양 배지를 추가하고 37°C에 놓습니다.
- 모든 장비(해부 현미경, 조직 다지기, 해부 램프, 해부 도구, 전극, 플레이트, 인서트 및 여과지)를 생물 안전 캐비닛 내부에 놓고 자외선 아래에서 15분 동안 살균합니다.
- 슬라이스 두께를 350μm로 조정합니다.
- 냉장고에서 GBSS를 꺼냅니다. 6개의 페트리 접시에 GBSS 5mL를 추가합니다. 동물당 6개의 페트리 접시가 필요합니다.
- 새끼 쥐를 안락사시킨다. 동물의 뇌간 기저부에 날카로운 가위를 사용하여 참수를 수행합니다.
- 동물의 머리를 차가운 GBSS로 세 번 씻고 안전 캐비닛 안으로 넣으십시오.
- 조직 분리 및 절편 준비
- 날카로운 집게를 눈구멍에 단단히 삽입하여 머리를 고정합니다.
- 얇은 가위를 사용하여 척추공에서 시작하여 전두엽을 향해 정중선을 따라 피부/두피를 자르고 옆에 둡니다.
- 같은 방법으로 두개골과 대뇌 횡단 열구(뇌와 소뇌 사이의 공간)를 따라 자릅니다. 구부러진 긴 집게로 멀리 움직입니다.
- 후각구는 주걱으로 버립니다. 머리에서 뇌를 제거하고 등쪽 표면이 위를 향하도록 하여 얼음처럼 차가운 GBSS에 놓습니다(그림 1A).
- 가는 집게를 소뇌에 삽입하고 주걱으로 각 반구를 매우 조심스럽게 벌리면서 정중선을 따라 이동합니다(그림 1B).
- 짧은 곡선 겸자로 해마 구조를 건드리지 않고 해마를 덮고 있는 여분의 조직을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 주걱으로 각 해마 아래를 자릅니다(그림 1C).
- 한쪽 반구를 집어 해마가 위를 향하도록 하여 여과지 위에 놓습니다. 다른 반구에 대해 절차를 반복하고 여과지에 첫 번째 반구와 평행하게 놓습니다. 반구가 블레이드에 수직이 되도록 티슈 초퍼에 여과지를 놓고 반구를 350μm 조각으로 자릅니다(그림 1D).
- 얇게 썬 조직을 차가운 GBSS와 함께 페트리 접시에 넣습니다(그림 1E).
- 둥근 팁 전극을 사용하여 슬라이스를 조심스럽게 분리합니다(그림 1F). 구조적으로 손상되지 않은 비강 피질과 해마가 있는 조각만 보관하십시오. DG 및 CA 영역뿐만 아니라 내후각 및 주위 피질도 완벽하게 정의되어야 합니다(그림 1G).
- 각 슬라이스를 주걱과 둥근 팁 전극을 사용하여 인서트(그림 1H-I)에 놓습니다. P20 피펫으로 각 슬라이스 주위의 과도한 박리 매체를 제거합니다(그림 1J). 4개의 rhinal cortex-hippocampus 절편을 단일 삽입체로 배양할 수 있습니다(그림 1K).
- 문화 유지 관리
- 격일로 매체를 변경합니다.
- 배지를 37°C에서 예열합니다.
- 인큐베이터에서 플레이트를 꺼냅니다. 집게로 플라스틱 가장자리를 잡고 각 삽입물을 들어 올립니다(그림 1L).
- 자유로운 손을 사용하여 우물에서 매체를 흡인합니다. 인서트를 웰에 다시 넣고 P1000 피펫과 함께 새로 데워진 배지 1mL를 추가합니다(그림 1M). 모든 삽입에 대해 반복합니다. 멤브레인과 매체 사이에 기포가 끼지 않도록 합니다.
메모: 간질과 같은 조각은 배지에서 점진적이고 통제된 혈청 박탈을 겪습니다. 9 Days In Vitro (DIV)부터 슬라이스는 HS 없이 NBA에서 유지됩니다.
2. 전기생리학적 기록
참고: 전기생리학적 기록은 계면형 챔버에서 7, 14 및 21 DIV의 rhinal cortex-hippocampus organotypic slice에서 수행되었습니다. 녹음은 증폭기로 얻고, 디지털화하고, 소프트웨어로 분석했습니다. 모든 녹음은 대역 통과 필터링(60Hz에서 8극 베셀 필터, 600Hz에서 가우시안 필터)되었습니다.
- 설정 준비
- B27 1mL 및 L-글루타민 250μL와 함께 NBA 배지 50mL를 준비합니다. 37 °C에서 예열합니다.
- 폐쇄 회로에서 전기 생리학 설정을 설정합니다. 유속이 2mL/분인지 확인합니다.
- 카박스(5% CO2/95% O2) 밸브를 열고 시스템의 수위를 확인합니다.
- 필터 용지를 인터페이스 기록 챔버에 넣어 초과 매체를 배출하고 프레임 아래의 렌즈 청소지를 슬라이스에 공급합니다.
- 온도 조절기를 켜고, ampliifiers 및 micromanipulator.
- 기록을 시작하기 전에 계면 챔버의 온도를 37°C에서 안정화합니다.
- 인공 뇌척수액(aCSF: 124 mM NaCl, 3mM KCl, 1.2 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 10 mM 포도당, 2 mM CaCl2, pH 7.4의 1 mM MgSO4)을 준비하고 이를 사용하여 유리 전극에 주사기를 채웁니다. 수신 전극에 놓습니다.
- 자발적인 활동의 기록
- 온도가 안정되면 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 매우 날카로운 칼날로 인서트에서 한 조각을 자릅니다. 매체 한 방울과 함께 60mm 접시에 놓습니다. 인터페이스 녹음 챔버로 가져가십시오.
- 해마가 오른쪽 아래에 오도록 하여 계면 챔버에 슬라이스를 놓습니다. 수신 전극을 CA3 피라미드 세포층에 놓습니다.
- 연속 획득 프로토콜로 진행하고 30분 동안 기록합니다.
