생체 외 간질 모델에서 세포 사멸을 평가하기 위한 신경 세포 사멸 분석

초록

출처: Carvalho, M., et al., Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures의 간질 형성 모델. J. Vis. 특급 (2021)

이 비디오는 rhinal cortex-hippocampus organotypic slices에서 신경 세포 사멸을 평가하는 기술을 보여줍니다. 신경 세포 사멸은 생체 내 간질과 유사한 진화하는 간질 발작을 통해 발생하며, 프로피듐 요오드화물과 면역 형광을 사용하여 죽은 세포의 이중 염색을 통해 감지됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. rhinal cortex-hippocampus slices의 준비

참고: rhinal cortex-hippocampus slices의 준비는 P6-7 Sprague-Dawley 쥐를 사용합니다.

1. 배양 설정 및 배지 준비
   1. 배양 전날에 필요한 배지를 준비하고 4°C에 놓습니다.
   2. 해부 매체 준비: Gey's Balanced Salt Solution(GBSS)에서 25mM 포도당.
   3. 배양 배지 준비: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% 말 혈청(HS), 25mM 포도당, 30μg/mL 겐타마이신.
   4. 유지 관리 매체 준비: Neurobasal-A(NBA), 2% B27, 1mM L-글루타민, 30μg/mL 겐타마이신, HS(15%, 10%, 5% 및 0%).
2. 두뇌 수확
   1. 배양을 시작하기 직전에 P1000 피펫을 사용하여 6웰 플레이트의 각 웰에 1.1mL의 배양 배지를 추가하고 37°C에 놓습니다.
   2. 모든 장비(해부 현미경, 조직 다지기, 해부 램프, 해부 도구, 전극, 플레이트, 인서트 및 여과지)를 생물 안전 캐비닛 내부에 놓고 자외선 아래에서 15분 동안 살균합니다.
   3. 슬라이스 두께를 350μm로 조정합니다.
   4. 냉장고에서 GBSS를 꺼냅니다. 6개의 페트리 접시에 GBSS 5mL를 추가합니다. 동물당 6개의 페트리 접시가 필요합니다.
   5. 새끼 쥐를 안락사시킨다. 동물의 뇌간 기저부에 날카로운 가위를 사용하여 참수를 수행합니다.
   6. 동물의 머리를 차가운 GBSS로 세 번 씻고 안전 캐비닛 안으로 넣으십시오.
3. 조직 분리 및 절편 준비
   1. 날카로운 집게를 눈구멍에 단단히 삽입하여 머리를 고정합니다.
   2. 얇은 가위를 사용하여 척추공에서 시작하여 전두엽을 향해 정중선을 따라 피부/두피를 자르고 옆에 둡니다.
   3. 같은 방법으로 두개골과 대뇌 횡단 열구(뇌와 소뇌 사이의 공간)를 따라 자릅니다. 구부러진 긴 집게로 멀리 움직입니다.
   4. 후각구는 주걱으로 버립니다. 머리에서 뇌를 제거하고 등쪽 표면이 위를 향하도록 얼음처럼 차가운 GBSS에 놓습니다(그림 1A).
   5. 가는 집게를 소뇌에 삽입하고 주걱으로 각 반구를 매우 조심스럽게 벌리면서 정중선을 따라 이동합니다(그림 1B).
   6. 짧은 곡선 겸자로 해마 구조를 건드리지 않고 해마를 덮고 있는 여분의 조직을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 주걱으로 각 해마 아래를 자릅니다(그림 1C).
   7. 한쪽 반구를 집어 해마가 위를 향하도록 하여 여과지 위에 놓습니다. 다른 반구에 대해 절차를 반복하고 여과지에 첫 번째 반구와 평행하게 놓습니다. 반구가 블레이드에 수직이 되도록 티슈 초퍼에 여과지를 놓고 반구를 350μm 조각으로 자릅니다(그림 1D)
   .
   8. 얇게 썬 조직을 차가운 GBSS와 함께 페트리 접시에 넣습니다(그림 1E).
   9. 둥근 팁 전극을 사용하여 슬라이스를 조심스럽게 분리합니다(그림 1F). 구조적으로 손상되지 않은 비강 피질과 해마가 있는 조각만 보관하십시오. DG 및 CA 영역뿐만 아니라 내후각 및 주위 피질도 완벽하게 정의되어야 합니다(그림 1G).
   10. 각 슬라이스를 주걱과 둥근 팁 전극을 사용하여 인서트(그림 1H-I)에 놓습니다. P20 피펫으로 각 슬라이스 주위의 과도한 절제 매체를 제거합니다(그림 1J). 4개의 rhinal cortex-hippocampus slice를 단일 삽입체에서 배양할 수 있습니다(그림 1K).
4. 문화 유지 관리
   1. 격일로 매체를 변경합니다.
   2. 배지를 37°C에서 예열합니다.
   3. 인큐베이터에서 플레이트를 꺼냅니다. 집게로 플라스틱 가장자리를 잡고 각 삽입물을 들어 올립니다(그림 1L)..
   4. 자유로운 손을 사용하여 우물에서 매체를 흡인합니다. 인서트를 웰에 다시 넣고 P1000 피펫과 함께 새로 데워진 배지 1mL를 추가합니다(그림 1M). 모든 삽입에 대해 반복합니다. 멤브레인과 매체 사이에 기포가 끼지 않도록 합니다.
      메모: 간질과 같은 조각은 배지에서 점진적이고 통제된 혈청 박탈을 겪습니다. 9 Days In Vitro (DIV)부터 슬라이스는 HS 없이 NBA에서 유지됩니다.

2. PI 흡수 분석

참고: 세포 사멸은 형광 염료 프로피듐 요오드화물(PI)의 세포 흡수를 모니터링하여 평가되었습니다. PI는 손상된 세포막이 있는 세포에 들어가 적색 형광을 방출하는 DNA와 상호 작용하는 극성 화합물입니다(흡광도 493nm, 방출 630nm). PI는 살아있는 세포에 투과되지 않기 때문에 집단에서 죽은 세포를 검출하는 데 사용됩니다.

1. PI 배양
   1. 배양 배지에서 PI 스톡의 새로운 1:10 희석을 준비합니다.
   2. PI 흡수 분석을 위해 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 인서트를 조심스럽게 올립니다. P20 피펫을 사용하여 13μL의 PI를 배지에 첨가하여 2μM의 최종 농도를 얻습니다. 인서트를 제자리에 다시 놓기 전에 플레이트를 천천히 교반합니다. 슬라이스 아래에 거품이 없는지 확인하십시오.
   3. 슬라이스를 37°C 인큐베이터에 다시 2시간 동안 넣습니다.
   4. 다음 섹션에 설명된 대로 면역조직화학 프로토콜(immunohistochemistry protocol)을 진행합니다. PI는 빛에 민감하기 때문에 플레이트를 알루미늄으로 덮으십시오.

3. 면역조직화학

참고: 면역조직화학에서는 뉴런 특이적 항체와 미세아교세포와 성상교세포의 휴지 및 반응성 표현형을 구별할 수 있는 항체를 사용하여 비뼈 피질-해마 간질과 같은 유기형 절편에서 신경 세포 사멸 및 신경교세포의 정도를 평가했습니다.

1. 조직 고정
   1. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 매체를 흡인합니다. P1000 피펫을 사용하여 슬라이스 아래와 위에 1mL의 PFA를 추가하여 RT에서 1시간 동안 4% 파라포름알데히드(PFA)로 슬라이스를 고정합니다.
   2. PFA를 제거하고 PBS 1mL를 추가합니다. 또한 슬라이스 아래와 위에 PBS를 추가합니다.
   3. 나중에 사용할 때까지 슬라이스를 PBS에서 4 °C로 유지하십시오. 건조를 피하기 위해 항상 접시 주위에 파라필름을 바르십시오.
2. 면역염색 단계
   1. PBS 1mL로 매번 10분씩 총 2회 세척합니다.
   2. PBS에 1% Triton-X100, 10% HS 및 10% BSA를 함유하는 투과화/차단 용액을 준비합니다. 5% BSA 용액을 준비합니다.
   3. 소수성 펜으로 두 개의 직사각형을 그립니다(그림 2A). 매우 날카로운 칼날로 인서트(그림 2B)에서 조각을 자릅니다. 슬라이드당 두 개의 슬라이스를 넣고(그림 2C) P200 피펫을 사용하여 각 슬라이스 상단에 140μL의 투과화/차단 용액을 추가합니다. RT에서 3시간 동안 배양합니다.
   4. PBS에서 5% BSA의 작동 희석액에 대한 1차 항체를 희석합니다. 1차 항체와 함께 4°C에서 밤새 배양합니다.
   5. RT에서 4시간 동안 2차 항체와 함께 배양합니다. 이 단계부터는 형광단이 작업되고 있으므로 플레이트를 빛으로부터 보호하십시오.
   6. 각 슬라이스 위에 50μL 방울의 Hoechst 용액을 놓고 RT에서 20분 동안 배양합니다.
   7. 배양 사이에 세척하십시오. 항상 PBS-T로 10분 동안 세 번 세탁하십시오.
   8. Hoechst를 제거하고 권장 사항에 따라 세탁하십시오.
   9. 각 슬라이스의 상단에 50μL의 장착 매체를 추가합니다. 유리 커버슬립으로 덮고 매니큐어로 둘러쌉니다(그림 2D).
   10. RT에서 24시간 동안 건조시킵니다.
   11. 컨포칼 현미경으로 면역염색을 시각화합니다. 염색된 조각은 -20 °C로 유지하십시오.

결과

그림 1: rhinal cortex-hippocampus organotypic slice 준비를 위한 세부 절차. (A) 머리에서 뇌를 제거하고 등쪽 표면이 위를 향하도록 얼음처럼 차가운 GBSS에 놓습니다. (B) 집게를 소뇌에 삽입합니다. 정중선을 통해 뇌를 열고 해마 위의 과도한 조직을 제거합니다. (C) 화살표로 표시된 대로 해마 아래를 자른 주걱으로. (D) 양쪽 해마를 위로 향하게 놓고 서로 평행하게 여과지에 놓고 조직 초퍼에서 350μm 슬라이스를 자릅니다. (E) 얇게 썬 해마를 얼음처럼 차가운 GBSS에 넣습니다. (F) 끝이 둥근 유리 전극을 사용하여 조각을 분리합니다. (

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
50 mL 원심분리기 튜브, 원뿔형 바닥	코 닝	430829
70% 에탄올	마누엘 비에이라, Lda	유엔1170
Anti-NeuN (토끼)	베르펜	16712943에스	1:500 비율로 희석
B-27™ 보충제 (50X), 무혈청	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제17504-044
메스 손잡이용 블레이드	정밀 과학 도구	10011-00
소 혈청 알부민(BSA)	NZY테크	MB04602	5% BSA는 1차 항체를 희석하는 데 사용됩니다. 10mL PBS에 0.5g BSA를 첨가합니다.
뇌/조직 슬라이스 챔버 시스템	워너 인스트루먼트
세포 배양 인서트, 30mm, 친수성 PTFE	밀리포어 SAS	PICM03050
차가운 광원	쇼트	KL 300 LED
컨포칼 레이저 현미경	자이스	LSM 710 (영문
기존 인큐베이터	Thermo Scientific 헤레우스	BB15, 기능 라인	37°C 및 5% CO2로 설정
D(+)-포도당 일수화물	머크 밀리포어	1.08342.1000
D-(+)-포도당 용액, 물 45%	시그마	G8769 (영문
디소듐 수소 인산염 이수화물	머크 밀리포어	1.06580.1000
해부 현미경/돋보기	메이지 테크노 주식회사	122285
당나귀 안티 토끼 IgG (H + L)와 Alexa Fluor 488 결합	인비트로젠	A21206	1:500 비율로 희석
Dumont #5 파인 펜치 바이오로지 이녹스	정밀 과학 도구	11254-20
Dumont #5 집게 스탠다드 이녹스	정밀 과학 도구	11251-20
Dumont # 7 집게 스탠다드 Dumoxel	정밀 과학 도구	11271-30
Dumont 메디컬 #7S 펜치 쇼트 커브 이녹스	정밀 과학 도구	11273-22
겐타마이신 원액, 50 mg/mL	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제15750-037
Gey의 균형 잡힌 소금 용액 (GBSS)	생물 산업	01-919-1ᄀ
유리 전극	과학 제품	GB150F-10	수제 라운드 팁
유리 파스퇴르 피펫, 230 mm	VWR 국제공항	612-1702
행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제24020-091
호스 세럼, 열 비활성화 (HS)
염산	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제26050-088
소수성 펜	머크 밀리포어	1.09057.1000
INCU-라인 IL10	다코	S200230-2
아이리스 스패튤라 커브드	워너 인스트루먼트	BSC-HT 하스 탑
Labculture 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛	정밀 과학 도구	10092-12
렌즈 청소지	헤라스사페	고등학교 12
L-글루타민 용액 200mM(Q)	티펜
마이크로 튜브 0.5 mL, PP	머크 밀리포어	1.05886.0500
마이크로 튜브 1.5 mL, PP	사르스테트	72,699
마이크로 튜브 2.0 mL, PP	사르스테트	72.690.001
Miroscope 커버 안경, 24mm x 60mm	셔터 계기	MP-285
매니큐어	마리엔펠트	102242
Neurobasal-A 미디엄 (NBA)	진부한 표현
Opti-MEM® I 리듀스-세럼 미디엄	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제10888-022
파라포름알데히드, 분말	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	31985-047
연동 펌프	VWR 화학 물질	2,87,94,295
인산염 식염수 완충액(PBS)	길슨	M312
인산염 표준 용액, PO43- 물			만든. 0.5% Tween-20(PBS-T)이 함유된 PBS는 면역조직화학 분석 중 절편을 세척하는 데 사용됩니다.
피펫 세트	BDH 아리스타	제452232호
플래티넘 5 블레이드	길슨	P2, P10, P20, P100, P200, P1000
요오드화 프로피듐(PI)	시그마-알드리치	P5405-250G
품질 여과지, 셀룰로오스, 1등급, 55mm	시그마-알드리치	P4170-25MG	물에 1mg/mL의 원액을 넣으십시오.
품질 여과지, 셀룰로오스, 1등급, 90mm	왓맨	1001-055	중간 유지율 11μm
메스 손잡이	왓맨	제1001-090	중간 유지율 11μm
슬립 팁 인슐린 주사기(바늘 없음) 1mL	정밀 과학 도구	91003-12
학생 가위 스트레이트 SharpSharp 12cm	Astro Med Inc GRASS 제품 그룹	S48 자극기
SuperFrost Plus™ 접착 슬라이드	정밀 과학 도구	91402-12
TC 처리 멸균 60 x 15mm 조직 배양 접시	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	J1800AMNZ
TC 처리된 멸균 6웰 플레이트	코 닝	CORN430166
티슈 헬기	의료 시스템 공사	TC-102
트리톤 X-100	미클 연구소 엔지니어링 CO., LTD.	선교사 훈련원/2	350μm로 설정
트윈-20	증권 시세 표시기	14630
	시그마	P2287

) 호 년 ) ) 년 년 년 년 ) 호 년 ) 호 ) 호 년 시리즈 ) 호 ) 년 년 호 년 년 ) 시리즈 년 (영문)