웜에서 화합물의 신경 보호 효과를 확인하기 위한 PolyQ 응집 분석

초록

출처: Wang, Q. et al. Caenorhabditis elegans는 폴리글루타민 매개 신경독성에 대한 생체 활성 화합물을 발견하기 위한 모델 시스템입니다. J. Vis. 특급 (2021년)

이 비디오는 선충의 체벽 근육 세포에서 polyQ 응집을 줄이고 응집 관련 단백질 독성을 개선하는 데 있어 신경 보호 테스트 화합물의 보호 가능성을 스크리닝하는 생체 내 방법을 설명합니다.

프로토콜

1. PolyQ 응집 분석

1. polyQ 응집 분석을 위한 선충 준비
   1. AM141의 300-500 동기화된 L1 유충을 OP50(0.7-0.8의 OD₅₇₀) 및 5mg/mL의 아스트라갈란을 포함하는 500μL의 S 배지가 있는 48웰 플레이트의 각 웰로 이동하며, 일반적으로 한 시점 동안 처리당 하나의 웰
   을 사용합니다.
   2. 파라필름으로 플레이트를 밀봉하고 20°C 및 120rpm에서 24, 48, 72 및 96시간 동안 배양합니다.
   3. 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 선충을 채취하고 M9 버퍼로 원심분리>로 3회(1분 동안 1000×g)로 세척하여 나머지 OP50을 제거합니다. AM141 선충을 M9 버퍼에 재현탁시키고 이미지 획득을 위해 준비합니다.
2. 형광 이미지 획득 및 데이터 분석
   참고: 데이터는 이 High-Content 이미징 시스템으로 자동 분석됩니다. 자동화된 이미징 장치를 사용할 수 없는 경우, 이미지 획득을 위해 아가로스 패드를 준비하는 기존 방법을 사용하여 일반적인 형광 현미경을 사용하여 유사한 성능을 달성할 수 있습니다.
   1. 10-15개의 선충을 384웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다(웰당 최종 부피 80μL). 각 처리에 대해 10개의 복제 웰을 설정합니다.
   2. 각 웰에 10μL의 200mM 아지드화나트륨을 첨가하여 선충을 마비시키고 바닥까지 가라앉도록 합니다(5-10분).
   3. 플레이트를 High-Content 이미징 시스템에 배치하여 형광 이미지를 획득합니다(장치 및 소프트웨어 정보는 재료 표 참조).
   4. 이미지 획득 소프트웨어를 열고 다음 매개변수를 설정합니다.
      1. Plate Acquisition Setup 창을 열고 새 실험 세트와 이름을 만듭니다.
      2. 배율을 2x로, 카메라 binning을 1로, Plate type을 384-well plate로 선택합니다.
      3. 방문할 우물과 사이트(단일 사이트)를 설정합니다.
      4. FITC(fluorescein isothiocyanate) 필터를 선택하고 이미지 기반 초점 옵션을 활성화합니다.
      5. 노출을 300ms.
         로 설정합니다. 메모: 이미징 매개변수를 최적화하기 위해 위의 설정을 테스트하고 조정할 수 있습니다.
      6. 이미지 획득 설정을 저장하고 Acquire Plate 버튼을 클릭하여 실행합니다.
   5. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지 데이터를 분석합니다.
      1. Review Plate Data 창을 열고 이미지 분석을 위한 Test plate를 선택합니다.
      2. 테스트 웰을 두 번 클릭하여 이미지를 표시합니다.
      3. 분석 방법으로 Count Nuclei를 선택하고 Configure Settings(설정 구성) 버튼을 클릭하여 다음 설정 창을 엽니다.
      4. FITC 채널에서 소스 이미지를 정의하고 표준 알고리즘을 선택합니다.
      5. 이미지 분석 매개 변수를 다음과 같이 설정합니다: 대략적인 최소 너비 = 10μm(= 2픽셀), 대략적인 최대 너비 = 50μm(= 12픽셀), 로컬 배경 위의 강도 = 1,000-2,000 graylevels.
      6. 현재 설정을 테스트하여 해석 방법을 최적화합니다.
      7. 설정을 저장하고 모든 wells.
         에서 분석을 실행합니다. 메모: 하나의 384웰 플레이트에 대한 분석을 완료하는 데 ~20분이 소요됩니다.
      8. Total Nuclei를 각 웰에 있는 Q40::YFP 응집체의 총 수로 내보냅니다.
   6. 각 우물에 있는 선충의 수를 세십시오.
   7. 각 그룹의 선충당 Q40::YFP 응집체의 평균 수를 계산하고 각 시점의 데이터에 비선형 곡선 피팅을 적용합니다.
   8. 억제 지수 계산:
      억제 지수 = (N_대조군 - N_샘플) / Ncontrol
      여기서 N_대조군과 N_표본은 각각 대조군과 처리군의 Q40::YFP 응집체의 평균 수입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C. 예쁜꼬마선충 균주
AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP]	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) (Caenorhabditis Genetics Center, 카에노르하브디티스 유전학 센터)		https://cgc.umn.edu/strain/AM141
대장균 균주
오피50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) (Caenorhabditis Genetics Center, 카에노르하브디티스 유전학 센터)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
시약
아지드화나트륨	공급자:Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551E96FF5F07CD
설비
384웰 세포 배양 플레이트	공급자:Nest Biotechnology Co., Ltd.	761001	https://www.cell-nest.com/page94? _l=en&product_id=85
48웰 세포 배양 플레이트	공급자:Nest Biotechnology Co., Ltd.	748001	https://www.cell-nest.com/page94? _l=en&product_id=85
형광 현미경	광저우 마이크로 탄 광학적인 기술 Co., 주식 회사.	엠샷 MF31-LED	https://www.mshot.com/ article/442.html
High-content 이미징 시스템	분자 장치	이미지익스프레스	https://www.moleculardevices.com/ 제품/세포 이미징 시스템#High-Content-Imaging
마이크로 원심분리기	진컴퍼니	제네스피드 X1	https://www.genecompany.com/ index.php/가정용품/goodsdetails/gid/189.html
파라필름 M	시그마-알드리치	P7793-1개	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
현미경 디지털 카메라	광저우 마이크로 탄 광학적인 기술 Co., 주식 회사.	MS60 (영문	https://www.mshot.com/article/677.html
소프트웨어
이미지 획득 및 분석 소프트웨어	분자 장치	메타익스프레스	https://www.moleculardevices.com/ 제품/cellular-imaging-systems/ acquisition-and-analysis-software/ Metaxpress