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삼투압 회피 분석을 사용한 형질전환 벌레의 화학회피 거동 조사

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

출처: Wang, Q. et al., Z. 폴리글루타민 매개 신경독성에 대한 생체 활성 화합물을 발견하기 위한 모델 시스템으로서의 Caenorhabditis elegans. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 형질전환 웜 모델에서 화학 회피 거동을 조사하기 위한 삼투압 회피 분석에 대해 설명합니다. 회피 행동은 고삼투압 장벽과 화학유인물질이 있는 플레이트에서 테스트됩니다. 뉴런의 기능적 상실을 가진 기생충은 화학유인물질에 끌려, 고삼투압 장벽을 넘어, 마취액 때문에 트랩 영역에서 마비된다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

참고: 이 프로토콜에 사용된 솔루션의 레시피는 표 1을 참조하십시오.

1. Caenorhabditis elegans 분석을 위한 재료 준비

  1. 예쁜꼬마선충(C. elegans) 균주의 유지
    1. 예쁜꼬마선충(C. elegans, AM141 및 HA759) 및 대장균(Escherichia coli, OP50 및 NA22) 균주를 얻습니다(재료표 참조).
    2. E. coli OP50이 파종된 선충 성장 배지(NGM) 플레이트에서 AM141의 경우 20°C 또는 HA759의 경우 15°C에서 선충을 유지합니다.
  2. 대장균 OP50 박테리아 배양의 준비
    1. Luria-Bertani(LB) 줄무늬 플레이트에서 E. coli OP50의 단일 콜로니를 선택하고 50mL의 액체 LB 배양액에 접종합니다.
    2. OP50 박테리아를 37°C 및 200rpm의 셰이커에서 570nm(OD570)에서 광학 밀도가 ~0.5가 될 때까지 배양합니다.
    3. OP50 박테리아 배양액을 4°C에서 보관하고 2주 이내에 사용하십시오.
  3. OP50 박테리아를 이용한 NGM 플레이트 준비
    1. 한천 20g, 펩톤 2.5g, NaCl 3.0g, 탈이온수 975mL를 1L 오토클레이브 병에 넣습니다. 121°C에서 30분 동안 오토클레이브합니다.
    2. 액체 NGM 한천 병을 벤치에 놓고 ~60°C로 냉각한 다음 1M CaCl2 1mL, 1M MgSO4 1mL, 5mg/mL 콜레스테롤 1mL 및 1M 인산칼륨 25mL(pH 6.0)를 추가합니다.
    3. 멸균된 90mm 페트리 접시에 NGM 20mL를 붓고 플레이트를 벤치에 두어 식히고 응고시킵니다. 접시를 거꾸로 놓고 실온의 벤치에서 2일 동안 건조시킵니다.
    4. OP50 박테리아 배양 200μL를 각 NGM 플레이트에 분주하고 멸균 유리 코팅 로드로 균일하게 펴 바릅니다. 뚜껑을 닫고 37°C에서 밤새 플레이트를 배양합니다.
    5. OP50이 주입된 NGM 플레이트를 뚜껑이 있는 플라스틱 상자에 넣어 실온에서 보관하고 2주 이내에 사용하십시오.
  4. 연령 동기화된 예쁜꼬마선충 개체군의 준비
    1. 임신성 선충을 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 1000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 세 번 세척하고 M9 완충액에 선충을 다시 현탁시킵니다.
    2. 같은 부피의 표백제 용액을 넣고 3-5분 동안 부드럽게 저어줍니다. 해부 현미경으로 15초마다 표백을 모니터링합니다.
      메모: 표백제 용액은 10% NaOCl과 1M NaOH를 동일한 부피로 혼합하여 사용하기 전에 새로 준비해야 합니다(표 1).
    3. 대부분의 선충이 깨지면 M9 완충액으로 희석하여 소화를 중단합니다. 빠르게 원심분리하여 상등액을 제거하고 펠릿을 M9 버퍼에 재현탁시켜 세척을 세 번 반복합니다.
    4. 펠릿을 S 매체에 재현탁시킵니다. 선충 잔류물이 2-3분 동안 중력에 의해 가라앉도록 하고 알은 상층액에 남아 있습니다.
    5. 상층액을 새로운 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 흡입합니다. 1000 ×g에서 1분 동안 원심분리하여 계란을 수집합니다.
    6. 상등액의 ~80%를 버리고 난자를 20mL의 S 배지가 들어 있는 멸균 플라스크로 옮깁니다. 플라스크를 셰이커에 넣고 음식 없이 120rpm으로 밤새 알을 부화시켜 동기화된 L1 선충을 얻습니다.

2. PolyQ 매개 신경독성 분석

  1. 시험 샘플을 사용한 C. elegans의 처리
    1. polyQ 신경독성 분석을 위해 선충을 준비하기 위해 HA759의 300-500 동기화된 L1 유충을 OP50(0.7-0.8의 OD570)과 5mg/mL의 아스트라갈란을 포함하는 500μL의 S 배지가 있는 48웰 플레이트의 각 웰로 이동하며, 일반적으로 각 처리에 대해 3개의 복제 웰
      2. 이 있습니다.
    2. 파라필름으로 플레이트를 밀봉하고 15°C 및 120rpm에서 3일 동안 배양합니다.
    3. 원심분리로 선충을 수집하고 M9 완충액으로 3-5회 세척합니다. 신경세포 생존 및 회피 분석에 사용하기 위해 M9 완충액에 선충을 재현탁합니다.
  2. 삼투압 회피 분석
    1. 식품이 없는 NGM 플레이트(9cm)를 정상(N)으로 나누고 중간에 8M 글리세롤(~30μL) 라인으로 트랩(T) 영역을 트랩합니다. 글리세롤 라인에서 ~1cm 떨어진 곳에 200mM 아지드화나트륨(~20μL) 라인을 펴서 글리세롤 장벽을 통과하여 T 구역으로 들어가는 선충을 마비시킵니다.
    2. ~200개의 선충을 각 그룹에 대한 3개의 복제 플레이트의 Zone N으로 각각 이동합니다. 1% 부탄디온(~2μL)을 Zone T(플레이트 가장자리에서 1cm)에 한 방울 떨어뜨려 선충을 유인합니다. 페트리 접시의 뚜껑을 즉시 덮고 23°C에서 90분 동안 배양합니다.
    3. 현미경으로 N 및 T 구역의 선충 수를 점수화합니다. eq.
      를 사용하여 회피 지수를 계산합니다. 회피 지수 = N / (T + N)
      여기서 N과 T는 각각 N과 T 구역에 있는 선충의 수입니다. 데이터는 3회 반복± >3개의 독립적인 실험을 대표하는 표준 편차(SD)의 평균으로 제공됩니다.
    4. 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정을 수행하여 복사군과 대조군의 데이터를 비교합니다.

표 1:

. . 합니다. . . . . 하십시오.
용액준비 지침보관
1 M CaCl2111 g 칼슘2실온(RT)에서 보관
dH2O를 1 L에 첨가
오토 클레이 브
1m 인산칼륨(pH 6.0)108.3 g KH2포4RT에 저장
35.6 케이2HPO4
dH2O를 1 L에 첨가
오토 클레이 브
1 M MgSO4246g 마그네슘4·7H2ORT에 저장
dH2O를 1 L에 첨가
오토 클레이 브
에탄올 중 콜레스테롤(5mg/mL)콜레스테롤 0.5g-20 °C에서 보관
100mL에 에탄올 첨가
오토클레이브하지 마십시오!
1 M 구연산칼륨(pH 6.0)구연산 일수화물 10.0g을 추가합니다RT에 저장
146.75g 삼칼륨 구연산 일수화물 추가
dH2O를 1 L에 첨가
오토 클레이 브
미량 금속 용액0.93g 이나트륨 EDTART에서 어두운 곳에 보관
0.345g 페소4·7H2O
0.1 g MnCl2·4H2영형
0.145g ZnSO4·7H2O
0.0125g CuSO4·5H2O추가
dH2O를 500 mL에 첨가
오토 클레이 브
1 m NaOHNaOH 4 gRT에 저장
100mL에 dH2O를 추가합니다
표백제 용액1m NaOH 0.5mL사용하기 전에 새로 준비하십시오.
10% NaOCl 0.5mL
M9 버퍼NaCl 5 gRT에 저장
3 g KH2PO4
6 g 나2HPO4
dH2O를 1 L에 첨가
오토 클레이 브
1 M MgSO4 1 mL 첨가
S 기초5.85 g 염화나트륨RT에 저장
6.0 g KH2PO4
1.0 g 케이2HPO4
dH2O를 973 mL에 첨가
오토클레이브, ~60°C로 냉각
에탄올에 5mg/mL 콜레스테롤 1mL 첨가
S 미디엄S 기저RT에 저장
1m CaCl2 3mL 추가
1m MgSO4 3mL 추가
1M 구연산칼륨 10mL 추가
미량 금속 용액 10mL 추가
모든 구성 요소는 오토클레이브되었으며 오토클레이브하지 마십시오
>5 mg/mL의 황기0.1 g 황기-80 °C에서 부분 표본에 보관하십시오
S 배지 20mL 추가
0.22μm 주사기 필터를 통한 필터
200mM의 아지드화나트륨1.3 g NaN34°C에서 보관
S 배지 100mL 추가
8 M 글리세롤글리세롤 73.67gRT에 저장
100mL에 dH2O를 추가합니다
10% 부탄디온 주식10 μL의 부탄디온과 90 μL의 dH2O를 혼합하십시오RT에 보관
1% 부탄디온10 μL의 부탄디온 스톡을 90 μL의 dH2O에 첨가RT에 보관
1 L의 Luria-Bertani (LB) 문화NaCl 10 gRT에 저장
트립톤 10 g
효모 추출물 5g
dH2O를 1 L에 첨가
오토 클레이 브

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
C. 예쁜꼬마선충 균주
HA759
rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]		Caenorhabditis Genetics Center (CGC) (Caenorhabditis Genetics Center, 카에노르하브디티스 유전학 센터)https://cgc.umn.edu/strain/HA759
대장균 균주
NA22Caenorhabditis Genetics Center (CGC) (Caenorhabditis Genetics Center, 카에노르하브디티스 유전학 센터)https://cgc.umn.edu/strain/NA22
오피50Caenorhabditis Genetics Center (CGC) (Caenorhabditis Genetics Center, 카에노르하브디티스 유전학 센터)https://cgc.umn.edu/strain/OP50
시약
한천상하이 EKEAR 바이오 테크놀러지 Co., Ltd.EQ1001-500Ghttps://www.ekear.com
부탄디온공급자:Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.80042427https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb
595d0
콜레스테롤시그마-알드리치C8667https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product
글리세롤공급자:Aladdin Co., Ltd.G116203https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html
펩톤광동 HuanKai 미생물 과학 기술 Co., Ltd.050170ᅡhttps://www.huankai.com/show/21074.html
아지드화나트륨공급자:Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.80115560https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af
551E96FF5F07CD
수산화나트륨공급자:Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10019718https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817
D3D8C68EC25E6
차아염소산나트륨 용액광저우 화학 시약 공장Tel.: 7681-52-9http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125
트립톤(주)옥소이LP0042Bhttps://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B
효모 추출물(주)옥소이LP0021Bhttps://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B
설비
48웰 세포 배양 플레이트공급자:Nest Biotechnology Co., Ltd.748001https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
90mm 페트리 접시Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (상하이)F611003https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003
오토 클레이 브파나소닉MLS - 3781L - PC
해부 현미경공급자:ChongQing Optical Co., Ltd.ZSA0745http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64
마이크로 원심분리기진컴퍼니제네스피드 X1https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
파라필름 M시그마-알드리치P7793-1개https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
셰이 커주식회사 ZhichengZWY-2102Chttp://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html
드 드

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