공동 배양에서 쥐 근아세포의 이동 능력을 평가하기 위한 상처 분석

초록

출처: Toubat, O. et al., Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 쥐 근아세포의 이동 능력을 평가하기 위한 비접촉 공동 배양 상처 치유 분석에 대해 설명합니다. 이는 체외에서 paracrine non-canonical Wnt 신호 상호 작용의 신호 전송 및 신호 수신 구성 요소를 이해하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 상처 분석:

(그림 1은 분석의 개략적인 모델을 보여줍니다)

1. 프로토콜의 이 부분을 진행하기 전에 O9-1 cell insert와 C2C12 cell chamber well이 두 cell이 ~70-80% confluency가 될 때까지 incubator에서 부착 및 증식하도록 합니다. 세포가 >90% 포화도 이하로 자라면 세포가 웰에서 분리되기만 하므로 스크래치 분석을 진행하지 마십시오.
2. 1x PBS 및 C2C12 매체를 37°C 수조에 넣어 따뜻하게 합니다.
3. C2C12 챔버에서 상등액 매체를 제거하고 1x PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 1x PBS를 제거하고 멸균 P10 피펫 팁으로 즉시 셀을 긁습니다.
   1. 멸균 P10 피펫 팁을 한 방향으로 단단히 통과시켜 셀 단층의 전체 길이 또는 너비에 걸칩니다(예: 오른쪽에서 왼쪽으로, 위에서 아래로). 셀이 포함된 각 웰은 한 번만 긁어야 합니다.
      메모: 스크래칭 결과를 최적화하려면 서로 다른 실험 조건의 웰을 유사한 수준의 포화도에서 스크래치합니다. 이를 위해 각 4-챔버 웰에 필요한 각 실험 조건(예: 웰 #1 음성 대조군, 웰 #2 양성....

결과

그림 1: 분석의 개략도 모델.1단계에는 STO 공급세포를 사용한 C2C12 근아세포 및 NCC의 체외 확장이 포함됩니다. 2단계는 공동 배양 시스템에서 NCC 및 C2C12 세포의 도금을 포함합니다. 3단계에는 세포 이동 능력을 평가하기 위해 기저 C2C12 세포에서 수행된 상처 분석이 포함됩니다. 4단계는 phalloidin에 대한 면역 염색을 통해 마이그레이션된 세포의 세포학적 구조와 형태를 평가합니다. 약어: NCCs = neural crest cells; Ab = 항체.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C2C12 쥐 근아세포 세포주	증권 시세	CRL-1772
챔버 슬라이드 시스템, 4웰	써모피셔 사이언티픽	154526
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 고포도당(4.5g/L), 글루타민(2mM)	코 닝	10-017-CV	4 °C에서 보관
눈금이 매겨진 멸균 피펫 팁, 10 μL	미국 과학	제1111-3810
O9-1 신경능선세포주	밀리포어 시그마	SCC049
인산염 완충 식염수(PBS), 1x, 칼슘 및 마그네슘 미포함, pH 7.4	코 닝	21-040-이력서	4 °C에서 보관
0.4μM 투명 PET 멤브레인이 있는 24웰 플레이트용 Falcon 투과성 서포트	코 닝	353095
소 태아 세럼	피셔 사이언티픽	W3381E는	-20 °C에서 50 mL 부분 표본에 보관
Zeiss 도립 Axio Vert.A1 광학 현미경	칼 자이스 AG
Zen lite 2012 현미경 소프트웨어	칼 자이스 AG		이미징 소프트웨어

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