공동 배양에서 쥐 근아세포의 이동 능력을 평가하기 위한 상처 분석

초록

출처: Toubat, O. et al., Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 쥐 근아세포의 이동 능력을 평가하기 위한 비접촉 공동 배양 상처 치유 분석에 대해 설명합니다. 이는 체외에서 paracrine non-canonical Wnt 신호 상호 작용의 신호 전송 및 신호 수신 구성 요소를 이해하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 상처 분석:

(그림 1은 분석의 개략적인 모델을 보여줍니다)

1. 프로토콜의 이 부분을 진행하기 전에 O9-1 cell insert와 C2C12 cell chamber well이 두 cell이 ~70-80% confluency가 될 때까지 incubator에서 부착 및 증식하도록 합니다. 세포가 >90% 포화도 이하로 자라면 세포가 웰에서 분리되기만 하므로 스크래치 분석을 진행하지 마십시오.
2. 1x PBS 및 C2C12 매체를 37°C 수조에 넣어 따뜻하게 합니다.
3. C2C12 챔버에서 상등액 매체를 제거하고 1x PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 1x PBS를 제거하고 멸균 P10 피펫 팁으로 즉시 셀을 긁습니다.
   1. 멸균 P10 피펫 팁을 한 방향으로 단단히 통과시켜 셀 단층의 전체 길이 또는 너비에 걸칩니다(예: 오른쪽에서 왼쪽으로, 위에서 아래로). 셀이 포함된 각 웰은 한 번만 긁어야 합니다.
      메모: 스크래칭 결과를 최적화하려면 서로 다른 실험 조건의 웰을 유사한 수준의 포화도에서 스크래치합니다. 이를 위해 각 4-챔버 웰에 필요한 각 실험 조건(예: 웰 #1 음성 대조군, 웰 #2 양성 대조군)에 대한 셀이 있는지 확인합니다. 또한 각 긁힘에 대해 새 멸균 P10 피펫을 사용하고 매번 피펫에 비슷한 양의 힘을 가하십시오. 각 웰에 두 개 이상의 스크래치를 만들려고 시도하지 마십시오.
   2. 긁은 후 P1000 피펫 팁을 사용하여 1mL의 1x PBS를 웰에 빠르게 추가합니다. 긁힐 각 우물에 대해 이 과정을 반복합니다.
      메모: 각 스크래치와 관련된 가변성을 감안할 때 각 실험 조건에서 상처 생성을 위해 여러 웰(n = 3)을 사용하는 것이 좋습니다. 이 단계에서 셀에 1x PBS가 없는 기간을 최소화하는 것이 중요하므로 신속하게 작업하십시오. 각 웰에서 1x PBS를 제거한 후 각 웰에 상처가 생기는 데 5초 이상 걸리지 않아야 합니다.
4. 상처를 생성하고 각 웰에 1x PBS를 다시 추가한 후 명시야 도립 현미경을 사용하여 스크래치를 이미지화하고 이 이미지를 기준선 상처 크기(시간 0)로 사용합니다. 이미지를 촬영하려면 다음 단계를 수행합니다.
   1. 전원 버튼을 눌러 컴퓨터와 현미경(재료 표 참조)을 켭니다. 챔버 슬라이드를 스테이지에 놓고 대물렌즈 다이얼을 5배 배율로 돌립니다.
   2. 컴퓨터 바탕 화면에서 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 이미징 소프트웨어(재료 표 참조)를 엽니다. 소프트웨어 홈 화면에서 카메라 탭을 클릭합니다. 라이브 버튼을 클릭하여 AxioCam IC 탭의 셀을 시각화합니다.
   3. 빛이 카메라와 컴퓨터 화면으로 통과할 수 있도록 광 필터를 완전히 당겨 빼냈습니다. 챔버 슬라이드를 수동으로 이동 및/또는 회전하여 AxioCam IC 탭의 라이브 이미지 중앙에 상처 부위를 배치합니다.
   4. 이미지를 촬영하려면 스냅을 클릭하여 이미지가 포함된 AxioCam IC 탭 옆에 있는 새 탭을 엽니다.
   5. 이 정지 이미지를 저장하려면 소프트웨어 홈 페이지의 왼쪽 위에 있는 파일 | 다른 이름으로 저장 | 파일 이름 상자에 파일 이름을 입력합니다. 그림을 Carl Zeiss 이미지(*.czi) 형식(기본 설정)으로 저장하고 왼쪽 막대에서 바탕 화면을 선택하여 파일을 Zen lite 2012 소프트웨어 프로그램에서만 열 수 있는 .czi 파일로 바탕 화면에 저장합니다.
   6. 그림을 .tiff로 저장하려면 파일 | 다른 이름으로 저장 | 파일 이름 상자에 파일 이름 입력을 클릭합니다. 파일 형식 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 *.tiff를 선택하여 Figure를 태그가 지정된 이미지 파일(*.tiff)로 저장합니다.
      메모: .tiff 형식은 모든 이미지 처리 소프트웨어에서 열 수 있습니다.
   7. 챔버 슬라이드의 위치를 수동으로 변경하여 동일한 웰에 있는 상처의 다른 지점에서 2-3개의 이미지를 더 촬영합니다.
      메모: 전체적으로 이렇게 하면 각 우물에 있는 상처의 겹치지 않는 고배율 이미지가 3-4
   개 생성됩니다.
5. 각 웰에서 1x PBS를 제거하고 C2C12 medium.
   1mL를 추가합니다. 메모: 상처 발생 후 챔버 웰에 용액을 제거하거나 추가할 때 너무 공격적으로 피펫팅하지 않도록 주의해야 하며, 이로 인해 세포가 챔버 웰에서 분리될 수 있습니다. 또한, 챔버를 잘 기울여 각 웰의 모서리에서 용액의 흡인 및 재도입이 수행되어 세포 단층 파괴를 최소화할 수 있습니다.
6. 챔버 웰의 각 웰에 O9-1 세포를 포함하는 삽입물을 수동으로 배치하여 웰 인서트 공동 배양 시스템을 조립합니다. 삽입물의 바닥이 기본 C2C12 세포 바로 위에 놓이도록 삽입물을 웰 안으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 웰 삽입 구조를 incubator.
   로 반환합니다. 메모: 인서트 바닥이 기본 C2C12 셀에 물리적으로 닿아 기계적으로 파괴되지 않도록 하십시오.
7. 세포가 총 9-12시간 동안 이동하도록 합니다. 최적의 이동 시간을 결정하려면 상처 생성 후 6시간 후에 세포를 확인하고 그 후에는 2-3시간마다 세포를 확인합니다. 대조군 또는 양성 대조군 조건의 세포가 상처를 완전히 덮기 시작하면 실험을 종료합니다.
   메모: 구조체의 비접촉 특성을 감안할 때, 간격 이동 진행을 확인할 때 위에 있는 삽입물을 웰에서 제거할 필요가 없습니다. 이 분석에 사용된 세포 유형, 상처 생성 시점의 세포 밀도, 생성된 상처의 너비, 조작된 세포의 실험 조건(예: 유전자 녹다운, 재조합 단백질 추가)과 같은 요인에 따라 이동 변동성이 관찰됩니다. 이러한 시약의 농도는 제조업체 권장 사항의 지침에 따라 실험적으로 측정해야 합니다.

결과

그림 1: 분석의 개략도 모델.1단계에는 STO 공급세포를 사용한 C2C12 근아세포 및 NCC의 체외 확장이 포함됩니다. 2단계는 공동 배양 시스템에서 NCC 및 C2C12 세포의 도금을 포함합니다. 3단계에는 세포 이동 능력을 평가하기 위해 기저 C2C12 세포에서 수행된 상처 분석이 포함됩니다. 4단계는 phalloidin에 대한 면역 염색을 통해 마이그레이션된 세포의 세포학적 구조와 형태를 평가합니다. 약어: NCCs = neural crest cells; Ab = 항체.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C2C12 쥐 근아세포 세포주	증권 시세	CRL-1772
챔버 슬라이드 시스템, 4웰	써모피셔 사이언티픽	154526
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 고포도당(4.5g/L), 글루타민(2mM)	코 닝	10-017-CV	4 °C에서 보관
눈금이 매겨진 멸균 피펫 팁, 10 μL	미국 과학	제1111-3810
O9-1 신경능선세포주	밀리포어 시그마	SCC049
인산염 완충 식염수(PBS), 1x, 칼슘 및 마그네슘 미포함, pH 7.4	코 닝	21-040-이력서	4 °C에서 보관
0.4μM 투명 PET 멤브레인이 있는 24웰 플레이트용 Falcon 투과성 서포트	코 닝	353095
소 태아 세럼	피셔 사이언티픽	W3381E는	-20 °C에서 50 mL 부분 표본에 보관
Zeiss 도립 Axio Vert.A1 광학 현미경	칼 자이스 AG
Zen lite 2012 현미경 소프트웨어	칼 자이스 AG		이미징 소프트웨어

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