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1. 혜성 분석을 위한 재료 준비
- 현미경 슬라이드 준비
- 50mL 튜브와 전자 레인지에 1 % (w / v) 정상 융점 아가로 로즈 [이중 증류수 (ddH2O)에 용해]를 붓고 ddH2O. 37 ° C에서 아가 로스를 용해시켜 슬라이드를 코팅하기 전에 응고를 방지하십시오. 응고가 발생하면 버리고 새로 준비하십시오.
1- %(w/v)의 정상 융점 아가로스를 함유한 50mL 튜브에 슬라이드를 담궈 프리코트 현미경 슬라이드를 만듭니다.
- 슬라이드를 담근 후 슬라이드 뒷면을 빠르게 닦습니다.
메모: 슬라이드 뒷면을 제대로 닦지 않으면 현미경으로 분석하는 동안 슬라이드의 배경 소음이 증가합니다.
- 코팅된 슬라이드에 반투명 섹션의 오른쪽 하단 모서리에 있는 영구 마커로 레이블을 지정합니다(그림 1A). 이것은 슬라이드의 어느 면이 사전 코팅되어 있는지 보여줍니다.
- 아가로스를 굳히고 실온에서 밤새 말리십시오.
- 건조된 슬라이드를 티슈 페이퍼로 싸서 상자에 보관하십시오.
2. 샘플 준비
- 배양된 세포
메모: 첫째, 혜성 분석을 시작하기 전에 세포를 손상시키는 물질로 처리하십시오. 그런 후 다음을 수행합니다.
- 세포가 부착되어 있는 경우, 세포의 적절한 포화 지점에서 세포 배양 플라스크 또는 세포 배양 페트리 접시에서 세포를 분리하기 위해 세포를 트립신화합니다. 혈청 함유 배지를 첨가하여 트립신을 중화합니다.
- 세포를 50mL 튜브, 원심분리기(예: HaCaT의 경우 실온에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리)로 옮기고 상등액을 부드럽게 제거한 다음 PBS 1mL를 세포 펠릿에 추가합니다.
- 세포 계수를 수행합니다.
- 30,000개의 세포를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 4°C에서 5분 동안 7,607 x g으로 원심분리합니다.
- 혜성 분석을 수행하기 전에 상등액을 부드럽게 제거하고 어두운 곳에서 얼음 위에 세포 펠릿을 보관하십시오.
메모: 보고된 바와 같이 인공물 DNA 손상 및 DNA 손상 반응 변형의 형성을 방지하기 위해 혜성 분석을 수행하기 전에 세포에 대한 마이코플라스마 오염 여부를 정기적으로 검사해야 합니다. 원심분리 조건은 사용된 세포 유형에 따라 필요에 따라 변경될 수 있습니다.
- 복구 분석을 위한 배양된 세포의 준비
- 세포 배양 플라스크 또는 페트리 접시에 있는 배양 세포.
- 치료 중 복구가 발생하지 않도록 얼음에서 손상제(예: BE-M17 세포의 경우 20분 동안 50μM의 H2O2로 처리)로 세포를 처리하기 전에 1mL의 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
- PBS 1mL로 세포를 두 번 부드럽게 세척하여 잔류 손상 물질을 제거합니다.
- 세포 배양 배지를 다시 도입하고 가습된 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에서 다양한 기간(예: 0분, 30분, 2시간, 6시간, 24시간 및 30시간) 동안 세포가 복구되도록 합니다.
- 각 시점에서 10% DMSO(dimethyl sulfoxide) 함유 세포 배양 배지에 30,000개의 세포를 수집하여 -80°C에서 보관합니다.
- 혜성 분석을 수행하기 전에 수조에서 37°C에서 세포를 빠르게 해동하고 4°C에서 5분 동안 7,607 x g에서 원심분리합니다.
- 상층액을 제거하고 분석을 수행하기 전에 세포 펠렛을 얼음 위에 보관하십시오(즉, 3단계부터).
3. 세포 용해
참고: 얼음 위에서 모든 절차를 수행하십시오.
- 젤당 12,000개의 세포 또는 2.5μL의 전혈을 사용합니다.
- PBS에 용해된 0.6%(w/v) 저융점 아가로스를 전자레인지를 이용하여 준비하고, 응고를 방지하기 위해 37°C의 수조에 넣는다.
- 영구 마커나 연필을 사용하여 사전 코팅된 슬라이드의 젖빛 끝에 연구자의 이름, 날짜 및 치료 정보를 레이블로 붙입니다.
- 평평한 벤치에 냉각판을 놓고 두 개의 냉동 냉각 팩을 금속 표면 아래의 슬라이딩 서랍에 삽입합니다(그림 2 참조).
- 냉각 플레이트에 슬라이드를 놓고 0.6%(w/v) 저융점 아가로스 함유 셀을 추가하기 전에 슬라이드를 1-2분 동안 사전 냉각시킵니다.
메모: 냉각 플레이트의 슬라이드를 1-2분 이상 방치하면 주변 습도로 인해 슬라이드 표면에 결로가 형성될 수 있습니다. 이로 인해 저융점 아가로스 젤이 슬라이드에서 덜 안정적일 수 있습니다.
- 볼텍싱(vortexing)에 의해 펠릿을 분산시킨다(단계 2.2.7). 펠릿에서 모든 상등액이 제거되었는지 확인하십시오. 샘플 튜브(펠릿화된 세포 포함)를 즉시 ice.
에 다시 놓습니다.
메모: 샘플 함유 튜브를 원심분리기에 넣을 때 펠릿이 튜브의 이쪽에 모이도록 힌지가 바깥쪽을 향하도록 놓습니다. 펠릿이 보이기 어려운 경우가 있고, 상층액을 제거하면서 펠릿을 빼내기 쉽습니다. 이 방향으로 튜브 뚜껑을 원심분리하면 세포 펠릿이 어디에 있는지 알 수 있습니다.
- 세포 펠릿을 200μL의 0.6% 저융점 아가로스(LMP 아가로스)로 재현탁하고 기포를 생성하지 않고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 다음으로, 80μL의 LMP 아가로스 함유 세포를 칠드 슬라이드로 빠르게 옮기고 커버슬립을 겔에 빠르게 놓습니다.
- 젤을 냉각 플레이트에 1-2분 동안 굳히십시오.
- 한편, 500mL의 용해 완충액(표 1)을 준비하고 용해 접시에 붓습니다(그림 3).
- 젤이 굳어지면 엄지와 검지 사이의 슬라이드를 부드럽게 잡고 커버슬립을 젤에서 밀어내어 커버슬립을 빠르게 제거합니다.
- 샘플이 들어있는 슬라이드를 슬라이드 캐리어 내부에 넣은 다음(슬라이드의 모든 검은색 "점" 표시는 캐리어에 넣을 때 같은 방향을 향해야 함)(그림 1B), 슬라이드 캐리어를 용해 접시 내부에 넣습니다(그림 3).
- 용해 접시의 뚜껑을 닫고 용해 접시를 4°C 또는 실온에서 30분 중 작업자의 시간표에 가장 적합한 방식으로 냉장고에 하룻밤 동안 보관하십시오.
4. 전기영동
- 용해 접시에서 슬라이드 캐리어를 조심스럽게 제거합니다. 젤을 방해하지 않도록 주의하십시오.
- 얼음처럼 차가운 ddH2O가 미리 적재된 세척 접시에 슬라이드 캐리어를 부드럽게 놓고 슬라이드가 ddH2O로 완전히 덮이도록 30분 동안 그대로 둡니다.
- 최적의 버퍼 온도를 유지하기 위해 전기영동 탱크 아래의 슬라이딩 서랍 내부에 얼어붙은 냉각 팩을 삽입합니다.
- 얼음처럼 차가운 전기영동 작업 용액(표 1)을 전기영동 탱크에 조심스럽게 추가하고 슬라이드 캐리어를 전기영동 탱크로 옮깁니다. 셀을 포함하는 젤이 있는 투명한 부분(즉, 젖빛/라벨링 끝이 아님)이 음극(빨간색 전극)을 가리키도록 슬라이드의 방향을 지정합니다.
- 슬라이드를 전기영동 탱크에 20분 동안 두어 DNA가 이완되고 풀리도록 합니다. 이 단계에서 전원 공급 장치를 끈 상태로 유지하십시오.
- 필요한 경우 냉각을 최대화하기 위해 새 냉동 냉각 팩을 삽입하십시오.
- 1.19 V/cm 또는 최적화된 조건에서 20분 동안 전기영동을 수행합니다.
메모: 전기영동 실행 조건과 완충액의 부피를 최적화하는 것은 모든 실험실에 권장됩니다. 전기영동 중 단일 슬라이드 캐리어만 사용하는 것은 전기영동 버퍼의 저항에 대한 슬라이드의 영향을 일으키지 않으며, 저자는 슬라이드 수가 변경될 때 전압 또는 전류에 큰 영향을 미치지 않았습니다.
- 전원 공급 장치를 끄고 전기 영동 탱크에서 슬라이드 캐리어를 조심스럽게 제거한 다음 티슈 페이퍼에서 30초 동안 배수되도록 합니다.
- 슬라이드 캐리어를 중화 버퍼가 들어 있는 접시에 놓습니다(표 1). 20분 동안 그대로 두십시오.
- 중화 접시에서 슬라이드 캐리어를 제거하고 얼음처럼 차가운 ddH2O가 들어 있는 세척 접시에 넣고 20분 동안 그대로 둡니다.
- 물에서 슬라이드 캐리어를 제거하고 작업자의 일정에 따라 37°C의 인큐베이터에서 1시간 동안 또는 실온에서 밤새 건조하거나 건조하지 마십시오.
메모: 4.11단계에서 건조가 없으면 5.2부터 염색 단계를 수행합니다.
5. 요오드화 프로피듐(PI) 염색
- 슬라이드 캐리어를 얼음처럼 차가운 ddH2O가 들어 있는 세척 접시에 옮겨 슬라이드를 재수화하고 30분 동안 그대로 둡니다.
- 슬라이드 캐리어를 2.5μg/mL 프로피듐 요오드화물 용액이 들어 있는 염색 접시에 넣습니다.
메모: Propidium iodide는 빛에 민감하므로 어두운 곳에서 취급하십시오. 또한 독성이 있습니다.
- 염색 접시의 뚜껑을 닫고 실온의 어둠 속에서 20분 동안 배양합니다.
- 슬라이드 캐리어를 별도의 접시에 옮기고 얼음처럼 차가운 ddH2O로 20분 동안 씻습니다.
- 접시에서 슬라이드 캐리어를 제거하고 작업자의 일정이나 선호도에 따라 37°C 인큐베이터 또는 실온에서 어두운 곳에서 완전히 건조시킵니다.
- 슬라이드가 완전히 건조되면 슬라이드 캐리어에서 슬라이드를 제거하고 이미지 분석이 준비될 때까지 어두운 슬라이드 상자에 보관합니다.
메모: 슬라이드는 무기한 읽을 수 있으며 필요한 경우 다시 염색할 수 있습니다.
6. 혜성 채점 및 데이터 분석
참고: "혜성"이라는 용어는 분석이 수행된 후 현미경으로 볼 때 손상된 세포의 이미지에서 파생되었습니다(그림 4). 전기영동 조건에서 손상되지 않은 세포의 DNA는 대체로 이동하지 않고 혜성 "머리"라고 하는 회전 타원체에 남아 있습니다. 그러나 가닥 절단의 존재로 인해 세포의 DNA가 머리에서 이동하여 "꼬리"를 형성하여 혜성과 같은 모양으로 나타날 수 있습니다(그림 4). 꼬리에 DNA가 많을수록 더 많은 손상이 발생합니다.
- PI(빨간색) 필터(λ = 536/617nm)와 혜성 분석 스코어링 소프트웨어를 사용하여 형광 현미경을 켭니다.
- 파스퇴르 피펫을 사용하여 젤에 물 한 방울을 넣고 커버 슬립으로 덮습니다.
- 슬라이드를 형광 현미경에 넣고 혜성에 "점수"를 매깁니다.
메모: 점수 매기기는 각 혜성에 존재하는 피해의 양을 결정하기 위해 혜성을 평가하는 수단입니다. 대체로, 이것은 사용자가 선택한 선호도에 따라 눈(0에서 4까지의 척도로 혜성의 크기를 측정)이나 자유 또는 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어를 사용하는 두 가지 접근 방식을 사용하여 달성할 수 있습니다30. 일반적으로 두 접근 방식 모두 혜성 꼬리의 크기를 평가하지만 다양한 혜성 관련 종점을 결정할 수 있습니다. 소프트웨어를 사용하는 경우 혜성 머리의 중앙을 클릭하고 소프트웨어가 혜성을 자동으로 감지할 때까지 기다린 다음 선택한 종점을 평가합니다(그림 4).
- 겔당 50개의 혜성과 샘플당 100개의 혜성을 기록합니다(즉, 각 샘플은 서로 다른 DNA 손상 처리 또는 복제에 해당
).
- 실험을 반복하거나(n = 2) 실험을 세 배로 늘립니다(n = 3).
메모: n=2 반복 실험만 수행하는 경우 통계 분석을 수행할 수 없지만 n=3인 경우 D'agostino 정규성 검정을 수행합니다. 대부분의 혜성 분석 데이터는 정규성 테스트를 통과하지 못합니다. 이 경우 비모수 검정을 사용합니다(Dunn의 다중 비교 검정을 사용한 Kruskal-Wallis 검정 및 p < 0.05에서 설정된 Mann-Whitney 검정).
| 시약 | 재고 솔루션 | 작업 솔루션 |
| 용해 버퍼 | ddH2O에서 100 mM Na2EDTA, 2.5 M NaCl 및 10 mM Tris 염기; 10 M NaOH로 pH를 10으로 조정 | 1% Triton X-100 용해 원액 |
| 전기영동 완충액 | ddH2O에서 10 m NaOH 및 200 mM Na2EDTA | 300 mM NaOH 및 1 mM Na2EDTA, pH > 13 |
| 중화 버퍼 | ddH2O에서 0.4 M 트리스 베이스; HCl로 pH를 7.5로 조정 | |
| 염색 완충액 | 1 mg/mL 프로피듐 요오드화물 | 2.5 μg/mL 프로피듐 요오드화물(ddH2O) |
표 1: 고처리량 알칼리성 혜성 분석(HTP ACA)에 사용되는 시약의 구성. lysis, electrophoresis, neutralization 및 staining buffer의 stock 및 working 농도가 표시됩니다.
