아미노산의 세포 흡수를 정량화하기 위한 방사성 표지된 아미노산 흡수 분석

초록

출처: Shen, L., et al. 배양된 뼈 세포 및 분리된 뼈 샤프트의 아미노산 소비 평가. J. Vis. 특급 (2022).

이 동영상은 골수 유래 기질 세포의 아미노산 흡수를 추정하기 위한 체외 기술을 보여줍니다. Na⁺-의존성 아미노산 수송체는 세포 내부의 방사성 표지된 아미노산의 흡수를 매개하며, 세포 흡수는 방사능을 측정하여 추정합니다.

프로토콜

방사성 물질(RAM)의 사용은 각 기관의 지정 안전 위원회의 사전 승인이 필요합니다.

1. 세포의 아미노산 흡수

1. 플레이트: 5 x 10,⁴ ST2 세포를 12웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 있습니다. 10% FBS, 100U/mL 페니실린 및 0.1μg/mL 스트렙토마이신(Pen/Strep)을 함유한 α-MEM의 플레이트 셀. 1.12단계에서 정규화에 대한 조건별 세포 수를 정량화하기 위해 세포의 추가 웰을 플레이트화합니다. 37°C의 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 5% CO₂로 세포를 배양합니다.
2. 합류할 때까지 2-3일 동안 세포를 배양합니다.
3. 실험 당일, 다음 용액을 준비합니다: 1x 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4 및 크렙스 링거 헤페스(KRH) 완충액, pH 8.0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, NaHCO₃, 5 mM HEPES, 1 mM D-글루코스). 37 °C로 예열합니다.
4. 배지를 흡인하고 1x PBS 1mL, pH 7.4.
   로 세포를 두 번 세척합니다. 메모: 이 프로토콜은 비합류 세포를 빠르게 분열시키는 데에도 적합합니다. 이 경우 방사능을 절대 세포 수 또는 DNA 함량으로 정규화하는 것이 중요합니다. 또한 배양 플레이트 또는 플라스크의 크기를 늘려 전체 세포 수와 cpm 값을 늘리는 것이 좋습니다. 이것은 개별적으로 경험적으로 결정하는 것이 중요합니다.
5. 1x PBS를 흡입하고 1mL KRH로 세포를 한 번 세척합니다.
6. KRH.
   1mL당 4μL의 [1 μCi ^μL-1] L-[3,4-3 H]-글루타민 스톡을 희석하여 4 μCi/mL L-[3,4-3 H]-글루타민 작업 매체를 만듭니다. 메모: 방사성 물질을 사용하기 전에 본국의 방사선 안전 사무국에 연락하여 승인을 받으십시오. 방사선과 관련된 모든 절차는 플렉시 유리 실드 뒤에서 수행해야 합니다.
7. 4 μCi/mL L-[3,4-3 H]-글루타민 작업 배지를 포함하는 0.5 mL의 KRH로 세포를 5분 동안 배양합니다.
8. 방사성 매체를 모아 액체 폐기물 용기에 분배합니다. 얼음처럼 차가운 KRH로 세포를 짧게 세 번 세척하여 반응을 종료합니다. 방사성 액체 폐기물 용기에 세척된 모든 것을 모아 버립니다.
9. 각 웰에 1% SDS 1mL를 추가하고 10배를 분쇄하여 세포를 용해 및 균질화합니다. 세포 용해물을 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 세포 배양 플레이트, 혈청학적 피펫 및 피펫 팁은 고형 방사성 폐기물 용기에 폐기합니다.
10. >10,000 x g에서 10분 동안 원심분리기. 상등액을 8mL의 섬광 용액이 들어 있는 섬광 바이알로 옮깁니다. 섬광 바이알을 세게 흔들어 섞습니다. 튜브와 피펫 팁은 고형 방사성 폐기물 용기에 버리십시오.
11. Scintillation 카운터를 사용하여 분당 카운트(cpm) 단위의 방사능을 읽습니다. 섬광 바이알은 섬광 바이알 폐기물 용기에 버리십시오.
12. 세포의 나머지 비방사성 플레이트에서 세포를 트립신화, 재현탁 및 계수하여(1.1단계 참조) 용해된 방사성 배양에서 세포의 수를 추정합니다. 혈구계를 사용하여 각 실험 조건에 대한 비방사성 웰당 세포 수를 계산합니다. 1.11단계의 cpm을 비방사성 플레이트에서 추정된 세포 수까지 정규화합니다.
13. 실험이 완료된 후 세포 배양 후드, 벤치 및 모든 기기의 오염을 방사능 오염 제거 스프레이로 오염 제거합니다. 마지막으로 와이프 테스트를 수행하여 작업 영역에 방사선이 없는지 확인합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.25% 트립신	지브코	25200
12웰 플레이트	코 닝	3513
Beckman LS6500 섬광 카운터
염화칼슘	시그마	C1016
염화콜린	시그마	C7077
D-(+)-포도당 용액	시그마	G8769 (영문
디피에스	지브코	14190
헵스(1M)	지브코	15630
L-[3,4-3H(N)]-글루타민	퍼킨엘머	NET551250UC
액체 섬광 바이알	시그마	Z190535
염화리튬 용액, 8M	시그마	L7026
염화마그네슘	시그마	M8266
맘α	지브코	12561
마이크로 원심분리기 튜브, 15mL	바이오틱스	89511-256
염화칼륨	시그마	P3911
중탄산나트륨	시그마	S6014
소금	시그마	S9888
나트륨 도데 실 설페이트	시그마	436143
Ultima Gold(신틸레이션 솔루션)	퍼킨엘머	6013329
α-(메틸아미노)이소부티르산	시그마	M2383

년 년 ) 년 년 년 (영문) 시리즈